步 達(dá)，姚 曉，鄭紫婷，李 祥，陳建偉

南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023

明黨參Changium smyrnioides Wolff 為傘形科(Umbellifarae)多年生草本植物，去皮的根供藥用。始載于明、清時期，為現(xiàn)版《中國藥典》的名貴中藥之一。分布于江蘇、安徽、浙江、江西、湖北等省，江蘇為地道藥材產(chǎn)區(qū)。外形和療效似人參，具潤肺化痰、養(yǎng)陰和胃、平肝解毒之功效，為我國重點保護(hù)的珍稀瀕危植物［1］。7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素和珊瑚菜內(nèi)酯均是從明黨參中分離得到的香豆素類化合物，藥理研究表明，這四種香豆素類化合物具有明顯的抗腫瘤作用和抗氧化作用［2］。目前國內(nèi)外對明黨參根、莖葉、果實的研究已有文獻(xiàn)報道［3-6］，但對明黨參組培產(chǎn)物中香豆素成分的含量測定尚未見報道，本研究建立了同時測定四種香豆素成分含量的測定方法，并比較了其在組培和栽培品不同部位的含量，為其資源的合理開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

實驗材料于2012 年9 月采自南京市仙林羊山，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)教研室陳建偉教授鑒定為明黨參Changium smyrnioides Wolff。鮮根帶土移栽到南京中醫(yī)藥大學(xué)藥苑中，在自然情況下培養(yǎng)。根據(jù)之前9 種激素條件下對明黨參葉片愈傷情況的優(yōu)選，采用培養(yǎng)基組成為MS+2，4-D 0.5mg/L +KT 0.2 mg/L+NAA 1.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L;MS+2，4-D 1.0 mg/L+KT 0.1 mg/L+NAA 1.5 mg/L+6-BA1.5 mg/L 進(jìn)行明黨參葉片的愈傷組織誘導(dǎo)和根誘導(dǎo)，并將愈傷組織和根誘導(dǎo)產(chǎn)物取出干燥備用。

1.2 儀器

Agilent 1100 液相色譜儀，自動進(jìn)樣器，HT-230A 柱溫箱(HENGAoT ＆ D)，配Agilent-C18 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，Agilent 公司;KQ-500DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HH-S 恒溫水浴鍋(江蘇國勝實驗儀器廠);FA-1004 電子分析天平(上海天平儀器廠);LIBRORAEL-40SM 電子分析天平(SHIMADZU);島津UV-2401 紫外掃描儀。

1.3 試劑

對照品7-羥基香豆素(批號:20120327)、花椒毒酚(批號:20110819)和歐前胡素(批號:20110520)由上海源葉生物科技有限公司提供，所有對照品經(jīng)HPLC 峰面積歸一化法檢測質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在98%以上;珊瑚菜內(nèi)酯為本實驗室從明黨參果實中分離所得到，經(jīng)UV、IR、MS、1H NMR、13C NMR 鑒定確定為珊瑚菜內(nèi)酯，熔點103～104 ℃，面積歸一化法測得對照品純度為99.7%。乙腈(色譜純，美國天地有限公司);水為雙蒸水，其他試劑均為分析純(南京化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取對照品7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素和珊瑚菜內(nèi)酯13.03、13.02、12.08、15.53 mg，分別加甲醇超聲(300 W，40 kHz)溶解并定容，即得濃度分別為260.6、260.4、241.6、310.6 μg/mL 的對照品儲備液。分別精密移取對照品儲備液5、20、5、5 mL，用甲醇稀釋至7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素和珊瑚菜內(nèi)酯分別為50.12、13.02、57.29、68.33 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取干燥供試品粉末(過3 號篩)約1.0 g，精密稱定，置于50 mL 燒瓶中，加入甲醇50 mL，80 ℃加熱回流1 h，過濾，50 ℃減壓干燥，用20 mL 乙酸乙酯-蒸餾水(1∶1，V/V)萃取，共萃取3 次，合并乙酸乙酯層，50 ℃減壓干燥，用甲醇定容至10 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱為Agilent-C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-水(B)梯度洗脫程序:0～5 min，5% A;5～10 min，5%～35%A;10～15 min，35%～60%A;15～40 min，60%～85%A;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長314 nm;分析時間40 min;進(jìn)樣量為10 μL。在上述條件下，7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素及珊瑚菜內(nèi)酯理論板數(shù)均不低于8000。對照品和供試品的色譜圖，見圖1。

圖1 對照品及其供試品的HPLC 色譜圖Fig.1 Overlaid HPLC chromatograms of mixed standards(D)and samples (G1-G9)

2.4 線性關(guān)系

分別精密移取“2.1.1”項下7-羥基香豆素對照品儲備液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度;花椒毒酚對照品儲備液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度;歐前胡素對照品儲備液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度;珊瑚菜內(nèi)酯對照品儲備液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度。按“2.2”項下的色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。以峰面積Y(A)為縱坐標(biāo)，濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素及珊瑚菜內(nèi)酯線性回歸方程及線性關(guān)系，見表1。

表1 4 種香豆素類成分的線性關(guān)系Table 1 Linear relationships of 4 investigated coumarin

2.5 精密度試驗

精密移取混合對照品溶液10 μL，按“2.2”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，以峰面積計算7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素及珊瑚菜內(nèi)酯RSD 分別為1.50%、2.17%、2.56%、2.50%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，分別于0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，考察峰面積的變化，結(jié)果7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素及珊瑚菜內(nèi)酯面積的RSD 分別為1.01%、2.56%、1.91%、2.29%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取同批次明黨參愈傷組織粉末，按“2.1.2”項下方法制備6 份供試品溶液，以“2.2”項下色譜條件進(jìn)行含量測定，結(jié)果7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素及珊瑚菜內(nèi)酯的平均含量分別為0.5402、0.2836、0.0104、0.0143 mg/g，RSD 分別為1.54%、2.86%、2.75%、2.53%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量明黨參愈傷組織粉末約1.0 g，共9 份，精密移取7-羥基香豆素對照品(260.6 μg/mL)1.5、2.0、2.5 mL、花椒毒酚對照品(260.4 μg/mL)0.8、1.2、1.6 mL、歐前胡素對照品(241.6 μg/mL)0.02、0.03、0.04 mL、珊瑚菜內(nèi)酯對照品(310.6 μg/mL)0.03、0.04、0.05 mL 的儲備液，并按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，計算回收率。結(jié)果見表2～5。

表2 7-羥基香豆素加樣回收率試驗結(jié)果Table 2 Recovery results of 7-hydroxycoumarin

表3 花椒毒酚加樣回收率試驗結(jié)果Table 3 Recovery results of xanthotoxol

表4 歐前胡素加樣回收率試驗結(jié)果Table 4 Recovery results of imperatorin

表5 珊瑚菜內(nèi)酯加樣回收率試驗結(jié)果Table 5 Recovery results of phellopterin

2.9 供試品的含量測定

取9 批供試品，按“2.2.1.2”項下方法制備供試品溶液，以“2.2”項下色譜條件測定，并計算7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素及珊瑚菜內(nèi)酯的平均含量，結(jié)果見表6。

表6 不同供試品明黨參中7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素及珊瑚菜內(nèi)酯的含量Table 6 Determination of 7-hydroxycoumarin，xanthotoxol，imperatorin and phellopterin in different samples of C.smyrnioides (mg/g，n=3)

3 討論

3.1 波長的選擇

本實驗參照文獻(xiàn)［8，9］建立了多香豆素類成分同時測定的方法，如圖1 和表1 所示，在314 nm 波長處7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素、珊瑚菜內(nèi)酯具有良好的分離度和線性關(guān)系，能滿足明黨參藥材及組織培養(yǎng)物中多種香豆素成分的同時測定。在實際實驗中還選擇了268 nm 進(jìn)行了監(jiān)測，但綜合考慮靈敏度、穩(wěn)定性等因素，故使用314 nm 作為定量波長。

3.2 供試品溶液制備方法的選擇

經(jīng)過超聲處理及加熱回流2 種方法的對比實驗，結(jié)果表明加熱回流提取香豆素類成分的含量較高，故選取加熱回流提取法。比較了乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇等6 種提取溶劑，結(jié)果表明，采用甲醇作為提取溶劑，提取效率最高。經(jīng)20、30、40、60、90 min 回流時間比較表明，回流提取60 min 時，即可達(dá)到平衡。

3.3 流動相的選擇

本實驗比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸-水、乙腈-磷酸-水、甲醇-醋酸-水、乙腈-醋酸-水系統(tǒng)及梯度洗脫條件下對樣品中花椒毒酚、歐前胡素、珊瑚菜內(nèi)酯、7-羥基香豆素分離度的影響，結(jié)果表明采用乙腈-水梯度洗脫時4 種香豆素類能得到良好的分離。

3.4 明黨參及其組織培養(yǎng)產(chǎn)物中香豆素類成分的累積規(guī)律分析

由表6 可見，7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素在9 份供試品中均有累積，珊瑚菜內(nèi)酯除愈傷組織根誘導(dǎo)產(chǎn)物中未檢出外，其余8 份均有累積，除歐前胡素外，其余三者在栽培品根皮部的含量最高，表明其成分在根中主要積累在根皮部;此外，明黨參栽培品的莖葉中4 種香豆素類成分均有累積，提示明黨參傳統(tǒng)工藝棄之根皮和葉具有再利用價值。除花椒毒酚外，栽培明黨參中其余3 種香豆素含量明顯高于野生品，這為野生變家種，擴(kuò)大藥用資源提供了一定依據(jù)。

3.5 明黨參不同組織培養(yǎng)產(chǎn)物中香豆素形成的分析

本實驗首次對明黨參組織培養(yǎng)兩個階段中的產(chǎn)物進(jìn)行了高效液相色譜含量檢測，從表6 中可以看出，明黨參愈傷組織和愈傷組織根誘導(dǎo)的產(chǎn)物中7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素、珊瑚菜內(nèi)酯均有累積，表明在明黨參愈傷組織形成階段已具有合成4 種香豆素類成分的能力，且前3 種成分在根誘導(dǎo)產(chǎn)物中的含量均高于愈傷組織，提示隨著明黨參愈傷組織再分化的進(jìn)行，香豆素類成分的生物合成累積量也隨之增多;但是在根誘導(dǎo)產(chǎn)物中尚未檢測出珊瑚菜內(nèi)酯，是否與缺少異戊烯轉(zhuǎn)移酶和O-甲基轉(zhuǎn)移酶有關(guān)，原因有待進(jìn)一步研究。

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