郭 美，王謙博，王宗偉，賈力維，王振月*

1黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，哈爾濱 150040;2 黑龍江省食品藥品檢驗檢測所，哈爾濱 150010

毛脈酸模(Rumex gmelini Turcz.)為蓼科酸模屬多年生宿根草本植物，多生于山區(qū)溝谷低濕草甸及雜草叢中，廣泛分布于黑龍江、吉林長白山等地區(qū)。毛脈酸模味甘性寒。有清熱解毒、涼血止血、通便利尿之功效，具有抗真菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)咳祛痰、平喘降壓、抗病毒和抗氧化等藥理作用。毛脈酸模中含有蒽醌類、二苯乙烯類、黃酮類以及酸模素類等化學成分［1，2］。其中蒽醌類化學成分具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、保肝、利膽、免疫抑制、瀉下等藥理作用［3-5］。

植物內生真菌(Endophytic fungus)是指生活在健康植物組織內部，不會對宿主造成明顯傷害，并與宿主植物建立和諧關系的一類真菌。內生真菌與宿主植物長期相互作用，建立了平衡關系，很可能遺傳物質相互傳遞。研究表明，內生真菌具有合成和宿主植物相同或相似活性成分的能力［6，7］。王玉美［8］等人從喜樹內生真菌中篩選出產喜樹堿的菌株，喜樹堿產量為774 μg/L;艾海新［9］等從南方紅豆杉樹皮中分離得到的內生真菌中篩選出一株產紫杉醇的菌株，其產量為53.68 μg/L。藥用植物內生真菌具有多樣性，可以產生有應用價值的代謝物質，利用內生真菌大規(guī)模發(fā)酵從而實現(xiàn)工業(yè)化生產，可以降低產品成本，滿足需求，同時有利于藥用植物資源的保護。內生真菌發(fā)酵培養(yǎng)作為尋找活性成分的手段之一，日益受到人們的重視。本課題組前期已從不同產地分離得到毛脈酸模內生真菌278 株，本實驗以不同產地毛脈酸模內生真菌為研究對象，通過HPLC 對其次生代謝產物進行研究，以大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素五種蒽醌類成分為參照，尋找有益菌株，并對成分較高的菌株進行含量測定，確定其產量，以確立進一步開發(fā)利用的價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

樣品為毛脈酸模中分離得到的278 株內生真菌，由本課題組前期從黑龍江省圖強(TQ)、塔河(TH)、新林(XL)、加格達奇(JQ)、綏棱(SL)、烏伊嶺(WY)、紅星(HX)、上甘嶺(SG)、桃山(TS)及黑龍江中醫(yī)藥大學藥用植物園(YY)十個產地分離得到。大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素對照品購買于中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 儀器與試劑

美國Waters 高效液相色譜儀(Waters 600 型泵，2487 型二極管陣列檢測器，Empower 色譜工作站);BSD-100 振蕩培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司);二級B2 型生物安全柜(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)。

甲醇:色譜純(美國DIKMA 試劑公司);磷酸:分析純(天津市天河化學試劑廠);水:飲用純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)

將活化后的菌株接種于錐形瓶中，28 ℃、160 rpm 下震蕩培養(yǎng)7 d。在60 ℃水浴下，將菌體與發(fā)酵液共同蒸干得內生真菌發(fā)酵產物。另取適量馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，60 ℃下水浴蒸干，作為空白對照。

1.2.2 供試品溶液的制備

取4 g 蒸干后的內生真菌發(fā)酵產物，置于圓底燒瓶中，加入甲醇20 mL，稱重。加熱回流，補足損失后濾過。得到內生真菌次生代謝產物的提取物。濾液過0.45 μm 濾膜，作為供試品溶液備用。同時將空白培養(yǎng)基及毛脈酸模植物根、莖、葉粉末做同樣處理。

1.2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素對照品2.75、4.15、3.10、3.70、2.50 mg，甲醇溶解，定容至25 mL 容量瓶內，配制成濃度依次為110、166、124、148、100 μg/mL 的對照品溶液;參照毛脈酸模根中各成分含量，分別依次精密稱取各對照品2.45、0.50、6.95、3.03、2.97 mg，甲醇溶解，定容至25 mL 容量瓶內，配成含大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素分別為98、20、278、121、119 μg/mL 的混合對照品溶液。

1.2.4 色譜條件的選擇

色譜柱Gemini C18分析柱(250 mm ×4.60 mm，5 μm)。流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長254 nm，進樣量10 μL。流動相為甲醇-0.1%磷酸水，梯度洗脫:0 min，30%甲醇;0～50 min，30%～100%甲醇;50～60 min，100%甲醇。此條件的混合對照品圖見圖1。

圖1 混合對照品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed reference

1.2.5 蒽醌類次生代謝產物的篩選及含量分析

按上述色譜條件進樣，記錄樣品色譜圖中各色譜峰的保留時間與峰面積，排除空白干擾，與對照品進行比對，進行初步篩選，得到含蒽醌類成分的內生真菌。為保證實驗結果的準確性，將含蒽醌類成分內生真菌的供試品溶液與相應成分的對照品溶液進行重復進樣比對，減小誤差。并進行含量測定。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

分別取五種對照品溶液，按照上述色譜條件進樣，依次進2、5、10、15、20 μL 以進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積Y 為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程得大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的線性回歸方程，線性范圍分別在0.220～2.200、0.332～3.320、0.248～2.480、0.296～2.960、0.200～2.000 μg 內，進樣量與峰面積呈良好的線性關系。回歸方程分別為:Y=1E+06X-128668，R2=0.9996;Y=3E+06X-111432，R2=0.9997;Y=2E+06X-269995，R2=0.9991;Y=1E +06X-232364，R2=0.9998;Y=2E +06X-146665，R2=0.9997。

2.2 精密度試驗

取混合對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6 次，測定峰面積，計算RSD 值，結果大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的RSD 值分別為0.6%、0.9%、1.0%、0.8%、1.1%。

2.3 穩(wěn)定性試驗

取混合對照品溶液，按上述色譜條件，分別在0、2、4、8、12 和24 h 進樣，分別測定大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的峰面積，計算RSD 值分別為1.2%、1.2%、1.3%、1.3%、1.1%。

2.4 重復性試驗

取毛脈酸模根部粉末6 份，按供試品溶液制備方法制備6 份供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素含量平均值的RSD 值分別為1.9%、2.0%、1.7%、1.3%、2.1%。

2.5 加樣回收率試驗

取已知含量的毛脈酸模根部粉末6 份，精密加入混合對照品溶液5 mL，按供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件進行測定，計算平均回收率，結果大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的平均回收率(n=6)分別為98.9%、100.4%、99.5%、103.7%、99.1%，RSD 值分別為1.14%、1.72%、0.89%、1.22%、0.97%。

2.6 蒽醌類次生代謝產物的篩選結果

按“1.2.2”的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進行測定。以大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素五種蒽醌類成分為參照，共篩選出11 株內生真菌含蒽醌類成分，其中含大黃素的有TH-R2、SL-R3、XL-S9;含大黃酸的有YY-S1、YY-S8、YY-S13;含蘆薈大黃素的有TQ-S4、TQ-S5、TQ-S16、JQ-S4、XL-S13。色譜圖見圖2。圖2 中各色譜圖由下到上依次為TH-R2、SL-R3、XL-S9、大黃素、YYS1、YY-S8、YY-S13、大黃酸、TQ-S4、TQ-S5、TQ-S16、JQ-S4、XL-S13、蘆薈大黃素、空白對照。從圖2 可以看出，同一產地的菌株成分較為相似，部分菌株除含有測定成分外還含有其他成分。

圖2 空白、對照品及樣品的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of blank，standards and samples

2.7 菌株概況及含量測定結果

樣品及毛脈酸模植物根、莖按“1.2.2”的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，其中原植物莖中未能直接檢測出相應的成分。將根、莖中離得到的內生真菌的含量與原植物根、莖中相應成分進行比對，其中菌除TH-R2 外，各菌株所含成分均比其分離部位的相應化學成分含量高，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 菌株的概況及樣品測定結果Table 1 The overview of endophytic fungi and the determination results of anthraquinones contents in samples

注:分離頻率是指樣本中分離到的某種內生真菌的菌株數(shù)占分離到總菌株數(shù)的百分數(shù)。R-從根中分離得到，S-從莖中分離得到。Note:Separation frequency refers to the percentage of strains of endophytic fungus isolated from each sample to the total number of strains.R-obtained from roots，S-obtained from stems.

3 討論

為了最大限度的提取發(fā)酵產物中的有效成分，本實驗以毛脈酸模原植物為參照，分別考察了甲醇回流、50%乙醇回流、甲醇超聲等提取方法，在同一色譜條件下測定，結果表明，甲醇回流及50%乙醇回流效果較好，考慮到方法操作簡便省時，本實驗采用甲醇回流后直接進行測定。并采取適合于毛脈酸?；瘜W成分分析的色譜條件進行測定，在五種蒽醌類對照品的基礎上，同時可對其它類有效成分進行考察，通過觀察液相色譜圖，尋找含其它類成分的菌株，在完成目標任務的同時可發(fā)現(xiàn)更多的有益菌株，以確立進一步開發(fā)利用的價值。

本研究確定有11 株內生真菌含有蒽醌類成分，相對宿主植物而言各菌株均有較高的含量，其中含大黃素的菌SL-R3 含量高達683 μg/g，為毛脈酸模蒽醌類成分中含量最高的內生真菌。從研究結果我們發(fā)現(xiàn)含蒽醌類成分的菌種青霉屬(Penicillium)、鏈格飽屬(Alternaria)、色串飽屬(Tolura)、鐮飽屬(Fusarium)等為分離頻率較高的菌種，同樣是毛脈酸模的優(yōu)勢菌種。結合各內生真菌的分離產地、分離部位，因此我們可進一步推斷，產生與宿主相同或相似化學成分的內生真菌可能與其自身的種屬、分離的環(huán)境及分離部位有關，接下來我們將進一步研究含量較高的內生真菌的穩(wěn)定性，以及大規(guī)模發(fā)酵的可行性，我們將通過優(yōu)化發(fā)酵條件，對菌株進行誘變育種等方式來進一步提高產量，以達到工業(yè)化生產的要求。本研究除發(fā)現(xiàn)含蒽醌類成分外，部分菌株還含有其它化學成分，這也說明內生真菌次生代謝產物豐富多樣，為我們對內生真菌的進一步研究奠定基礎。

1 Wang ZY(王振月)，Ye WH(葉萬輝)，Yang RF(楊潤福).Investigation of Resource of Rumex gmelimi.J Chin Med Mater(中藥材)，1996，19:603-605.

2 Wang ZY(王振月)，Chen JM(陳金銘)，Wang QB(王謙博)，et al.Chemical components of Rumex gmelini (Ⅳ).Chin Trad Herb Drugs(中草藥)，2009，40:1352-1355.

3 Cao L(曹亮)，Zhou JJ(周建軍).The research progress of anthraquinone compounds.Northwest Pharm J(西北藥學雜志)，2009，24:237-238.

4 Karren DB，Razina R，Louisa G，et al.Antibacterial metabolites from Australian macrofungi from the genus Cortinarius.Phytochemistry，2010，71:948-955.

5 Jaw MC，Wen C，Ji HW，et al.Anthraquinones of edible wild vegetable Cassia tora stimulate proliferation of human CD4+T lymphocytes and secretion of interferon-gamma or interleukin 10.Food Chemistry，2008，107:1576-1580.

6 Yan JF(嚴菊芬)，Wang SP(王素萍)，Qi NB(齊寧波)，et al.Research progress of endophytic fungi from medicinal plants.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發(fā))，2012，24:176-181.

7 Chen DJ(陳道金)，Liu HM(劉慧敏)，Yang J(楊靜)，et al.Research Process on Active Constituents of Endophyte.Lishizhen Medicine and Materia Medica Reseach(時珍國醫(yī)國藥)，2013，24:1730-1732.

8 Ai HX(艾海新)，F(xiàn)eng YK(馮玉康)，Zhu CY(朱春玉)，et al.Isolation and identification of a Taxo-l Producing endophytic fungus LNUF014.J Microbiol(微生物學雜志)，2010，30(4):58-62.

9 Wang YM(王玉美)，Chen HZ(陳洪章).Isolation and identification of a camptothecin-producing endophytic fungus from Camptotheca acuminate.Institute of Microbiology(微生物學通報)，2011，38:884-888.