吳振恭，褚漢啟，熊俊，陳金川，劉云，陳金，周良強(qiáng)，熊浩

激光共聚焦顯微鏡和免疫組化染色對(duì)比觀察KCNQ1在小鼠耳蝸血管紋的表達(dá)

吳振恭1*，褚漢啟2*，熊俊1，陳金川1，劉云2，陳金2，周良強(qiáng)2，熊浩3

目的：采用激光共聚焦顯微鏡（LSCM）技術(shù)和免疫組化染色檢測(cè)KCNQ1在小鼠耳蝸血管紋中的表達(dá)分布特征。方法：以KCNQ1－/－突變純合子基因型小鼠和CBA/CaJ小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用免疫組化染色、LSCM結(jié)合免疫學(xué)標(biāo)記方法對(duì)比觀察血管紋KCNQ1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：免疫組化染色顯示CBA/CaJ小鼠血管紋邊緣細(xì)胞頂膜KCNQ1蛋白高表達(dá)，呈棕褐色；LSCM觀察顯示免疫單標(biāo)KCNQ1綠色熒光蛋白分布于CBA/CaJ小鼠血管紋邊緣細(xì)胞細(xì)胞核，KCNQ1－/－小鼠邊緣細(xì)胞均未見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。結(jié)論：LSCM技術(shù)能準(zhǔn)確顯示KCNQ1在小鼠耳蝸血管紋中表達(dá)及細(xì)胞定位。

KCNQ1；基因敲除小鼠；邊緣細(xì)胞；激光共聚焦顯微鏡

血管紋位于耳蝸外側(cè)壁，血供豐富，是構(gòu)成蝸管外壁的重要部分，由邊緣細(xì)胞、中間細(xì)胞、基底細(xì)胞三層構(gòu)成。目前認(rèn)為，血管紋中最主要的功能細(xì)胞是邊緣細(xì)胞，其主要功能是通過(guò)底側(cè)膜上的Na+-K+-ATP酶及NKCC1將血管紋內(nèi)間隙的K+轉(zhuǎn)運(yùn)到邊緣細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)，從而降低血管紋內(nèi)間隙中的K+濃度[1,2]。邊緣細(xì)胞內(nèi)的K+通過(guò)邊緣細(xì)胞頂膜的KCNQ1/KCNE1 K+通道，被動(dòng)流入內(nèi)淋巴[3,4]，從而完成K+向內(nèi)淋巴的擴(kuò)散，并維持內(nèi)淋巴的高K+狀態(tài)[5,6]。缺乏KCNQl則導(dǎo)致K+在邊緣細(xì)胞基底側(cè)膜至內(nèi)淋巴處分泌障礙，由于進(jìn)入內(nèi)淋巴的K+不足，主要由K+構(gòu)成的耳蝸內(nèi)電位下降甚至消失，導(dǎo)致在聲音的機(jī)械-電轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中K+進(jìn)入毛細(xì)胞的驅(qū)動(dòng)力下降，毛細(xì)胞去極化的程度降低，從而影響神經(jīng)遞質(zhì)釋放，最終造成聽(tīng)力損失。因此，了解邊緣細(xì)胞K+通道分布特點(diǎn)，對(duì)于全面理解血管紋參與耳蝸K+轉(zhuǎn)運(yùn)和K+循環(huán)機(jī)制具有十分重要的意義。目前，激光共聚焦掃描顯微鏡（laser scanning confocal microscopy，LSCM）技術(shù)不斷發(fā)展，其成像分辨率大大提高，且對(duì)熒光探針標(biāo)記細(xì)胞組織切片可進(jìn)行連續(xù)斷層掃描，無(wú)損傷，且精確、可靠。為此，本研究擬采用LSCM和免疫組化染色對(duì)比觀察邊緣細(xì)胞KCNQ1蛋白的分布特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 KCNQ1基因敲除小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackon實(shí)驗(yàn)室，由親代KCNQ1＋/－雜合子小鼠雌雄配對(duì)自行培育出第二代小鼠，按照孟德?tīng)栠z傳法則在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行培養(yǎng)繁殖，并基因鑒定出KCNQ1－/－小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。CBA/CaJ小鼠購(gòu)置于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，按SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與儀器 羊抗小鼠KCNQ1多克隆抗體，購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗羊IgG抗體，購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司；Fluoview FV500型LSCM購(gòu)于日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 耳蝸切片標(biāo)本制備 取4周齡小鼠，斷頸快速處死，取出聽(tīng)泡，在解剖顯微鏡下去除鐙骨，打開(kāi)前庭窗和圓窗，蝸尖鉆孔，4%多聚甲醛固定液灌流固定，并重固定于該固定液中24 h（4℃），固定后耳蝸經(jīng)0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphatic buffered saline，PBS）洗滌，然后用 10% EDTA脫鈣1周，每天更換脫鈣液1次，后移入30%蔗糖溶液沉淀過(guò)夜。采用日本SAKURA包埋劑包埋固定，沿蝸軸方向行冰凍連續(xù)切片，厚度約8～10 μm。

1.2.2 KCNQ1免疫組化染色（兩步法） 參照過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色法（streptavidin-peroxidase，SP）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。操作步驟：耳蝸冰凍切片3%過(guò)氧化氫去底物；5%正常羊血清封閉；加入一抗羊抗小鼠KCNQ1多克隆抗體（1∶200）4℃濕盒過(guò)夜；加入二抗生物素化標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體37℃溫育60 min；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素37℃孵育30 min；3'3-二氨基苯聯(lián)胺（diaminobenzidine，DAB）顯色；蘇木素復(fù)染；二甲苯透明；封片。以上步驟之間均用0.01 mmol/L PBS漂洗3遍，每次5 min。用PBS代替一抗為陰性對(duì)照。在光學(xué)顯微鏡下觀察并照相，陽(yáng)性為細(xì)胞內(nèi)有棕色的反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.3 LSCM技術(shù)成像 將冰凍切片進(jìn)行KCNQ1免疫單標(biāo)染色。切片常規(guī)室溫放置30 min后4℃丙酮固定，3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30 min，10%正常羊血清阻斷非特異性結(jié)合部位30 min，倒去血清，每例標(biāo)本滴加1∶200羊抗小鼠KCNQ1多克隆抗體，孵育、振洗，加入FITC標(biāo)記的兔抗羊IgG（1∶100），孵育、振洗，甘油封片，LSCM下觀察。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色

KCNQ1蛋白陽(yáng)性表達(dá)于血管紋邊緣細(xì)胞，呈棕褐色。KCNQ1－/－小鼠未見(jiàn)明顯陽(yáng)性變化，CBA/CaJ小鼠血管紋邊緣細(xì)胞頂膜陽(yáng)性表達(dá)顯著，見(jiàn)圖1。

圖1 KCNQ1－/－小鼠（A）和）CBA/CaJ小鼠（B）血管紋邊緣細(xì)胞KCNQ1蛋白表達(dá)（SP染色，×200）

2.2 LSCM觀察

KCNQ1蛋白陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞呈綠色熒光標(biāo)記。KCNQ1－/－小鼠邊緣細(xì)胞未見(jiàn)綠色熒光陽(yáng)性變化，CBA/CaJ小鼠血管紋邊緣細(xì)胞核可見(jiàn)陽(yáng)性高信號(hào)表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖2 LSCM觀察KCNQ1－/－小鼠（A）和）CBA/CaJ小鼠（B）血管紋邊緣細(xì)胞KCNQ1蛋白表達(dá)（FITC染色，×40）

3 討論

免疫組化染色作為一種定性研究，很難對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的空間分布進(jìn)行全面分析。本研究免疫組化染色結(jié)果顯示，CBA/CaJ小鼠血管紋邊緣細(xì)胞頂膜呈棕褐色樣陽(yáng)性表達(dá)，但無(wú)法進(jìn)行更準(zhǔn)確的細(xì)胞定位。同時(shí)，本研究應(yīng)用FITC免疫熒光單標(biāo)記KCNQ1，以L(fǎng)SCM觀察發(fā)現(xiàn)CBA/CaJ小鼠血管紋邊緣細(xì)胞核可見(jiàn)高熒光強(qiáng)度表達(dá)，與免疫組化相比，LSCM更直觀、準(zhǔn)確。LSCM是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，利用共聚焦成像的原理及激光波長(zhǎng)狹窄的優(yōu)點(diǎn)，使其成像清晰，分辨率較普通顯微鏡提高30%～40%，使用紫外或可見(jiàn)光激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像，在亞細(xì)胞水平上觀察細(xì)胞形態(tài)。

KCNQ1蛋白是一種電導(dǎo)很小的K+通道，廣泛分布于上皮與非上皮組織。依照目前的耳蝸鉀循環(huán)理論，KCNQ1在耳蝸K+循環(huán)及在維持耳蝸內(nèi)電位中起重要作用[7,8]。筆者課題組成員前期研究利用C57BL/6J小鼠耳蝸進(jìn)行免疫組化染色顯示，KCNQ1蛋白集中表達(dá)于血管紋的邊緣細(xì)胞頂膜，在耳蝸其他組織染色很弱[9]。李建玲等[10]采用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行對(duì)KCNQ1和NKCC1蛋白進(jìn)行研究表明，KCNQ1蛋白主要呈帶狀分布于耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞頂膜處。本研究證實(shí)KCNQ1蛋白存在于血管紋的邊緣細(xì)胞。

本研究中，免疫組化染色和LSCM分別顯示KCNQ1蛋白表達(dá)于血管紋的邊緣細(xì)胞頂膜或細(xì)胞核，兩者細(xì)胞具體定位有一定差異。國(guó)外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)血管紋邊緣細(xì)胞頂膜上有KCNQ1蛋白的表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)前庭暗細(xì)胞和血管紋邊緣細(xì)胞有Isk表達(dá)[11,12]。這種定位差異，筆者認(rèn)為可能跟熒光染色二抗是羊抗小鼠KCNQ1多克隆抗體，出現(xiàn)交叉反應(yīng)，造成假陽(yáng)性有關(guān)，有必要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

應(yīng)用免疫組化染色與LSCM觀察相比有不同優(yōu)缺點(diǎn)：首先，免疫組化染色是應(yīng)用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，但不能精確定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽(yáng)性，不易與背景區(qū)分；LSCM是利用激光作為光源，在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上采用共軛聚焦原理和裝置，并利用計(jì)算機(jī)對(duì)所觀察分析對(duì)象進(jìn)行數(shù)字圖象處理的一套觀察和分析系統(tǒng)。LSCM要求進(jìn)行熒光染色，需要考慮熒光染色的灰度混跡、熒光信號(hào)的損失、實(shí)驗(yàn)試劑增加費(fèi)用等方面。

本研究應(yīng)用LSCM技術(shù)證實(shí)KCNQ1蛋白免疫熒光標(biāo)記的陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于邊緣細(xì)胞上，與免疫組化染色相比，LSCM觀察更直觀。

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Expression and Subcellular Localization of KCNQ1 in Stria Vascularis of Mice Cochlea by Laser Scanning Confocal Microscopy and Immunohistochemistry Staining

Objective:To investigate the expression and distribution of KCNQ1 in stria vascularis of murine cochlea with laser scanning confocal microscopy (LSCM)and immunohistochemistry staining technique. Methods:With LSCM and immunohistochemistry staining,the location of KCNQ1 in cochlea of the CBA/CaJ and KCNQ1－/－mice were observed.Results:Immunohistochemical staining showed that the expression of KCNQ1 protein was found at the apical membrane wall of marginal cells in stria vascularis of CBA/CaJ mice. There was no KCNQ1 protein expression in marginal cells of KCNQ1－/－mice.The fluorescence of KCNQl protein was mainly expressed in the cell membrane of marginal cells of CBA/CaJ mice with LSCM.Conclusion: The expression and distribution of KCNQ1 protein in marginal cells of stria vascularis could be observed with LSCM.

KCNQ1;gene knockout mice;marginal cell;lascer scanning confocal microscopy

R741;R764

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.02.002

1.安溪縣醫(yī)院五官科福建 安溪 362400 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科武漢 430030 3.廣州中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科廣州 510120注：*為并列第一作者

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81271078）福建省泉州市衛(wèi)生局科研課題

2014-01-03

褚漢啟qi7chu@163.com