陳忠云，李珊珊，李婧，徐志偉，楊旭

阿司匹林廣泛應用于卒中的一、二級預防。研究表明，高危險因素的腦血管病患者，服用阿司匹林可降低25%的非致死性卒中[1]。然而，部分長期服用阿司匹林的患者，心腦血管事件的發(fā)生率并未降低，可能在一定程度上存在阿司匹林抵抗（aspirin resistance，AR）現象[2,3]。研究表明，遺傳因素在抗血小板藥物實驗室反應中起重要作用[4]。環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）為阿司匹林的主要作用靶點，近年有關COX-2基因多態(tài)性與AR的相關報道較多，但大多研究基于-765G>C位點[5]，關于-1195G>A位點的研究較少。基于此，本研究探討COX-2基因-1195G>A多態(tài)性與缺血性腦卒中（ischem ic stroke，IS）患者AR的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年12月至2013年6月我科收治的IS患者210例，均符合2010年中華醫(yī)學會神經病學分會發(fā)布的急性IS診斷標準[6]，并經頭顱CT和/或MRI證實，均為中國北方漢族，男123例，女性87例；平均年齡（64.96±12.57）歲；排除感染及血液系統(tǒng)性疾病，近1周未使用其他抗血小板藥物，如氯吡咯雷、華法林等。本研究經我院倫理委員會審查批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

參考Gum等[7]提出的實驗室診斷標準，以 10μmoL/L二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）誘導的血小板聚集率≥70%；以0.5mg/m L花生四烯酸（arachidonic acid，AA）誘導的血小板聚集率≥20%。2項都符合，為AR（n=17）；符合其中1項，為阿司匹林半抵抗（aspirin sem i-resistance，ASR）（n=46）；2項都不符合，為阿司匹林敏感（aspirin sensitive，AS）（AS組，n=147）。因AR患者較少，故與ASR患者合并為非AS組。全部患者住院次日清晨空腹抽取肘靜脈血，用全自動分析儀測定甘油三酯（triglyceride，TG）、膽固醇（Cholesterol，Cho）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）等指標。受試者清晨另空腹采肘靜脈血2m L，枸櫞酸鈉-K2抗凝，按照DNA提取試劑盒（購于北京天根公司）操作，提取全血標本DNA，－80℃保存?zhèn)溆?。采用TaqExpress軟件（購于美國ABI公司）設計引物和探針，由北京賽百盛生物技術公司合成。測定的基因型均通過測序法進行驗證。-1195 G>A點突變擴增片段長度119 bp，引物3′端-2位引入錯配堿基“T”（正配堿基應為“A”）。運用擴增阻滯突變系統(tǒng)（Ampli cation refractorymutation system，ARMS）結合TaqMan熒光探針的方法（ARMS-Taq-Man）檢測基因型，其中，野生引物為5′AAC AAA AGC AAA GAT GAA ATT CCTA 3′，突變引物為 5′ACA AAA GCA AAG ATG AAA TTC CTG 3′（序列中下劃線堿基是引入的錯配堿基，用以增加引物特異性），TaqMan序列為 5′HEL-TCT CCC TTC CAT CTA ATT AAT TCC TCA T-3′-BHQ。ARMS-TaqMan法的反應體系及測定條件：反應體系為20μL，反應液8μL，上、下游引物各1μL，增強液1μL，模板 2 μL，探針 1μL，H2O 6μL，使用 7 500熒光定量PCR測定儀（美國ABI公司）檢測探針羧基熒光素的熒光信號。-1195G>A點突變反應條件為 94℃ 5m in，94℃ 25 s，60℃35 s40個循環(huán)，以2~9個循環(huán)為基線，閾值為0.02確定循環(huán)閾值（Ct值）。ARMS-Taq-Man方法檢測不同基因型判定標準的建立：利用引物3′端與模板正配與錯配擴增效率不同，以已知濃度梯度不同基因型質粒標準品為模板，按上述反應條件，通過熒光信號檢測確定PCR反應有無指數擴增期和Ct值，確定可區(qū)分點突變檢測的濃度范圍。在可區(qū)分點突變檢測的濃度范圍內，以不同拷貝數的野生引物Ct值（Wct）和突變引物Ct值（Mct）差值Δct（Δct=Wct-Mct），根據總體均數計算 Δct的 99%可信區(qū)間（Δct±2.58 s）及PCR擴增時有無指數增長期，建立各種等位基因型的判定標準。1.3統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析。計數資料以百分數表示，組間比較用x2檢驗；定量資料以（均數±標準差）表示，采用t檢驗或W ilcoxon秩和檢驗。Hardy-Weinberg平衡檢驗，2組SNPs的基因型和等位基因的頻率差異采用x2檢驗或Fisher精確檢驗。多因素分析采用多元Logistic回歸分析。所有資料采用雙側檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基線資料比較

①AS組 147例，男 90例（61.2%）；年齡（64.39±12.45）歲；吸煙史 50例（34.0%），飲酒史36例（24.5%）；原發(fā)性高血壓91例（61.9%），糖尿病 53例（36.1%），冠心病 71例 （48.3%）；TG （1.46±0.71）mmol/L，Cho（4.49±1.17）mmol/L，HDL （1.13±0.29）mmol/L，LDL（2.83±0.84）mmol/L；②非AS組63例，男33例（52.4%）；年齡（66.29±12.83）歲；吸煙史 24例（38.1%），飲酒史17例（27.0%）；原發(fā)性高血壓40例（63.5%），糖尿病 17例（27.0%），冠心病 28例 （44.4%）；TG （1.31±0.59）mmol/L，Cho（4.51±1.11）mmol/L，HDL （1.11±0.28）mmol/L，LDL（2.76±0.71）mmol/L。各項指標組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 COX-2基因-1195G>A基因型和等位基因頻率分布

COX-2基因-1195G>A基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），具有群體代表性。應用x2檢驗比較-1195G>A位點基因型、顯性模型在2組間的分布頻率差異，結果提示差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。非 AS組中 -1195G>A位點（GA+AA）基因型頻率及A等位基因頻率高于AS組，差異均有統(tǒng)計學意義（x2=4.96，P=0.03；x2=5.50，P=0.02），見表 1。

2.3 多因素Logistic回歸分析

進一步采用多元Logistic回歸模型校正年齡、性別、吸煙史、飲酒史、原發(fā)性高血壓、糖尿病、冠心病、TG、TC、LDL及HDL后，結果顯示，與GG基因型相比，COX-2的-1195G>A位點（GA+AA）基因型發(fā)生AR可能性更大 （OR=2.41，95%CI為1.09~5.37，P=0.03）。

3 討論

根據檢測手段及研究人群的不同，AR發(fā)生率在國內外研究中差異很大，為5%~40%[7-9]。本研究中AR及ASR的發(fā)生率分別為8.1%和21.9%，與既往報道一致[10]。

COX-2位于1號染色體q25.2-q25.3，長約8.3 kb，由10個外顯子和9個內含子組成。COX-2為誘導型酶，在正常情況下，COX-2低表達或不表達，但在炎性介質、生長因子等體內外因素誘導下表達，可將AA轉化為前列腺素H2，前列腺素H2可增加血栓素A2的生成，從而誘導血小板聚集、粘附和血管收縮。本研究結果表明，與GG基因型及G等位基因相比，COX-2基因-1195G>A位點（GA+AA）基因型及攜帶等位基因A的IS患者發(fā)生AR的可能性更大。校正相關危險因素后，（GA+AA）基因型仍與AR的發(fā)生呈顯著相關（P=0.03），提示其可能是AR發(fā)生的獨立危險因素。這與國內徐旭等[11]的研究相一致。然而，國內亦有相反結論的報道，王毅盟等[12]研究發(fā)現-1195G>A位點基因型分布頻率在AS組及非AS組中存在統(tǒng)計學差異（P=0.02），但多因素分析提示-1195G>A位點與AR的發(fā)生無關。這些矛盾的結果可能與納入研究對象不同有關，既往研究對象包括冠心病、IS、肺梗死等患者，而本研究對象僅為IS患者，避免了病因不同所引起的偏移。此外，Chen等[13]研究提示，-1195G>A位點（GA+AA）基因型與IS密切相關，那么，-1195G>A位點突變的IS患者是否更易發(fā)生AR呢，仍需進一步研究。

-1195G>A位于啟動子區(qū)，啟動子區(qū)含多個轉錄因子結合位點，因此，其基因多態(tài)性可能改變基因的轉錄活性，進而影響COX-2的表達。Zhang等[14]研究發(fā)現，-1195G>A多態(tài)性改變可產生一個新的c-MYB的轉錄因子，從而增強COX-2基因的轉錄活性。既往研究提示，COX-2在動脈粥樣硬化的形成過程中發(fā)揮重要作用，并與粥樣斑塊的穩(wěn)定性有關[15]。COX-2的表達上調可促進巨噬細胞產生基質金屬蛋白酶對血管膠原的分解作用，從而使粥樣斑塊的穩(wěn)定性降低，進而導致患者對阿司匹林不敏感，從而產生AR。

綜上，本研究顯示，COX-2基因-1195G>A位點多態(tài)性可能是造成AR及ASR原因之一。因此，檢測COX-2基因-1195G>A位點多態(tài)性，對臨床實施個體化藥物治療，預防心腦血管病的發(fā)生具有重要意義。但仍需進行大樣本的前瞻性研究，進一步明確-1195G>A位點基因多態(tài)性與IS患者發(fā)生AR的相關性。

表1 COX-2基因-1195G>A基因型、顯隱性模型及等位基因分布頻率（n，%）

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