孟宇，呂俊，齊世美

（皖南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241001 E－mail：mengyu60＠163.com）

多糖作為一種具有特殊生物學(xué)活性功能的物質(zhì)，日益受到重視，其在抗腫瘤、抗病毒、增加免疫等方面具有一定的功能。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)牛蒡多糖對(duì)正常小鼠、環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠和S180肉瘤小鼠的免疫系統(tǒng)均有增強(qiáng)作用，不同劑量組的抑瘤率均明顯提高，同時(shí)能提高荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO 及吞噬活性［1］，但是牛蒡多糖對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。本課題旨在前期實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用MTT、RT－PCR 法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，初步探索牛蒡多糖是否對(duì)K562癌細(xì)胞體外增殖具有抑制作用，是否影響凋亡相關(guān)基因BCL－2、Bax mRNA 的表達(dá)，從而探討牛蒡多糖對(duì)K562細(xì)胞抑制作用的可能機(jī)制，尋找一種新的能夠誘導(dǎo)K562癌細(xì)胞凋亡的多糖，作為治療白血病的天然無(wú)毒副作用的藥物，為白血病治療藥物的研發(fā)提供必要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 RPMI－1640培養(yǎng)基 （南京凱基生物）；胰蛋白酶 （合肥志宏）；MTT （合肥志宏生物）；K562細(xì)胞株（引自皖南醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室）；RNA 提取試劑盒 （合肥志宏）；逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶聯(lián)反應(yīng) （RT－PCR）試劑盒 （合肥志宏）。CO2培養(yǎng)箱 （Excella Eco－170）；酶標(biāo)儀 （EPOCH）；倒置顯微鏡 （OLYMPUS）。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，置于24孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每孔加入100μl相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，設(shè)置陰性組，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h后。每孔加入20μl MTT （5mg／ml），培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100μl DMSO 溶解，搖床10 min輕輕混勻；λ＝490nm，測(cè)出OD值，計(jì)算抑制率：抑制率＝（1－試驗(yàn)組A490均值／空白對(duì)照組A490均值）×100%。

1.2.2 RT－PCR 測(cè)定BCL－2、Bax mRNA 的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2×105／ml均勻接種細(xì)胞于6孔板，每孔2 ml。分為陰性對(duì)照組和給藥組，給藥組分別加入牛蒡多糖5 μg／ml、10μg／ml、20μg／ml，作用30min后，所有組均培養(yǎng)48h后，用Trizol一步提取法提取細(xì)胞總RNA，紫外光分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度：樣品總RNA 濃度根據(jù)核酸稀釋倍數(shù)計(jì)算；所用RNA 純度：其OD260／OD280均在1.8～2.1之間。以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。以β－actin作為內(nèi)參照物。經(jīng)過(guò)模板DNA 的變性，模板DNA 與引物的退火，引物的延伸反應(yīng)后，取反應(yīng)液5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 9.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 牛蒡多糖對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制作用 牛蒡多糖作用于白血病K562細(xì)胞24h后，與對(duì)照組相比，牛蒡多糖5μg／ml組和10μg／ml對(duì)細(xì)胞的抑制率高于陰性對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.05），而20μg／ml組明顯抑制細(xì)胞增殖。牛蒡多糖作用于白血病K562細(xì)胞48h后，與對(duì)照組相比，牛蒡多糖5μg／ml組對(duì)細(xì)胞的抑制率高于陰性對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.05），而10μg／ml和20μg／ml組均顯著抑制K562細(xì)胞的增殖，如表1所示。

表1 牛蒡多糖處理24h、48h后對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制率 （±s）

表1 牛蒡多糖處理24h、48h后對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制率 （±s）

注：牛蒡多糖組與陰性組比較，a：P ＜0.05，b：P ＜0.01

?

2.2 牛蒡多糖對(duì)BCL－2和Bax基因表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，牛蒡多糖5μg／ml組對(duì)BCL－2 基因的表達(dá)下調(diào)，Bax的表達(dá)影響不大；與對(duì)照組相比，牛蒡多糖10μg／ml組對(duì)BCL－2基因表達(dá)明顯下調(diào)，Bax的表達(dá)上調(diào)；牛蒡多糖20μg／ml組對(duì)BCL－2基因表達(dá)明顯下調(diào)，對(duì)Bax的基因表達(dá)具有明顯的上調(diào)作用，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度牛蒡多糖對(duì)BCL－2和Bax基因表達(dá)的影響

3 討論

目前，環(huán)境污染越來(lái)越嚴(yán)重，白血病的發(fā)病率也逐年上升，尤其是慢性粒細(xì)胞白血病 （CML），是一種嚴(yán)重危害生命的造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，目前其主要的治療是傳統(tǒng)的姑息治療和化療，化療藥物主要有干擾素和阿糖胞苷［2］，但治療效果隨著時(shí)間增加而不佳，且存在嚴(yán)重的副作用，同時(shí)給病人帶來(lái)很大的痛苦。目前對(duì)牛蒡根的藥理活性研究較多，現(xiàn)代研究表明，牛蒡根具有抗菌［3］、抗突變、抗癌［4］、抗衰老［5］等作用。本課題組從牛蒡根中提取牛蒡多糖，并對(duì)其從提取工藝到藥理學(xué)功能等方面進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)牛蒡多糖一定劑量灌胃處理能提高小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖及IL－2、IFN－γ的分泌［6］，本實(shí)驗(yàn)室研究也顯示牛蒡多糖對(duì)正常小鼠、環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠S180 肉瘤小鼠的免疫系統(tǒng)均有增強(qiáng)作用，但牛蒡多糖對(duì)白血病的治療及抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)制并未見(jiàn)報(bào)道，是否對(duì)癌細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用不得而知。牛蒡多糖作為一種天然藥物，在治療腫瘤方面有著巨大的研發(fā)價(jià)值，本課題通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定牛蒡多糖對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制作用，并初步探討其機(jī)制，Bcl－2家族蛋白成員Bax和Bcl－2在線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路中起著重要的作用，抗凋亡蛋白Bcl－2可以通過(guò)阻止促凋亡蛋白Bax在線粒體膜上的作用而抑制細(xì)胞凋亡［7－8］，且Bcl－2／Bax比例大小與細(xì)胞是否會(huì)發(fā)生凋亡有密切關(guān)系［9－11］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用RT－PCR 方法檢測(cè)Bax和Bcl－2的基因表達(dá)，結(jié)果顯示BCL－2基因表達(dá)下調(diào)，Bax的基因表達(dá)增多，說(shuō)明牛蒡多糖對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制作用機(jī)制可能與BCL－2 基因表達(dá)下調(diào)，Bax的表達(dá)上調(diào)，并且調(diào)控Bcl－2／Bax比例有關(guān)，其進(jìn)一步機(jī)制有待繼續(xù)進(jìn)行研究。

［1］ 劉少芳，陳靠山.牛蒡低聚果糖對(duì)小鼠的免疫調(diào)控及抗腫瘤作用的研究 ［D］.濟(jì)南：山東大學(xué)，2007：29－48.

［2］ 朱磊，郭靜明.慢性粒細(xì)胞白血病的治療進(jìn)展 ［J］.航空航天醫(yī)藥，2010，21 （8）：1378－1379.

［3］ 林學(xué)政，劉春燕，陳靠山，等.不同地域牛蒡葉綠原酸的含量及其抑菌試驗(yàn) ［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2004，16 （4）：328－330.

［4］ 牛玲，唐莉莉.牛蒡抗突變作用的研究 ［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)：中文版，1997，17 （4）：343－344.

［5］ 李玉潔，劉樹(shù)明，李淑蓮，等.牛蒡根抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究 ［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2004，15 （9）：545－546.

［6］ 盛榮華，陳靠山，孟宇.牛蒡低聚果糖對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖和IL－2、IFN－γ產(chǎn)生的影響 ［J］.專家論壇，2011，18 （4）：5－6.

［7］ Borner C.The bcl－2 protein family：Sensors and checkpoints for life－or－death decisions［J］.Mol Immunol，2003，39 （11）：615－647.

［8］ Gross A，McDonnell JM，Korsmeyer SJ.Bcl－2family members and the mitochondria in apoptosis［J］.Genes Dev，1999，13 （15）：1899－1911.

［9］ Kuang YF，Chen YH.Induction of apoptosis in a nonsmall cell human lung cancer cell line by isothiocyanates is associated with p53and p21［J］.Food Chem Toxicol，2004，42 （10）：1711－1718.

［10］ Allsopp TE，Wyatt S，Paterson HF，et al.The proto－oncogene bcl－2can selectively rescue neurotrophic factor－dependent neurons from apoptosis［J］.Cell，1993，73 （2）：295－307.

［11］ Shen Y，White E.P53－dependent apoptosis pathways［J］.Adv Cancer Res，2001，82：55－84.