王 希，鐘耀廣*，市川壽

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.日本長(zhǎng)崎大學(xué)水產(chǎn)學(xué)部，長(zhǎng)崎 852-8043，日本）

響應(yīng)面優(yōu)化超聲波快速提取鱈魚皮中膠原蛋白的工藝研究

王 希1，鐘耀廣1*，市川壽2

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.日本長(zhǎng)崎大學(xué)水產(chǎn)學(xué)部，長(zhǎng)崎 852-8043，日本）

以冷凍阿拉斯加深海鱈魚皮為原料，利用響應(yīng)面分析法(RSM)優(yōu)化超聲波快速提取膠原蛋白的工藝。根據(jù)單因素試驗(yàn)影響因子的分析，選取pH、提取溫度、超聲波提取時(shí)間作為響應(yīng)面分析法中的影響因子，以膠原蛋白提取率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)立建立數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行響應(yīng)面分析。結(jié)果表明，最優(yōu)提取工藝：pH 2.0、溫度35℃、超聲波輔助提取時(shí)間3.5 h、酶解時(shí)間7.5 h，膠原蛋白提取率達(dá)33.75%。

響應(yīng)面；超聲波；膠原蛋白；鱈魚

膠原蛋白是占哺乳動(dòng)物總蛋白20%～30%的主要結(jié)構(gòu)蛋白[1]。支持和保護(hù)身體各器官，是結(jié)締組織結(jié)構(gòu)蛋白重要主體[2]。膠原分子多肽鏈相互纏繞成一種三螺旋結(jié)構(gòu)[3]。膠原蛋白提取可使用或結(jié)合酸提取、堿提取、鹽萃取、酶法提取、熱水提取法提取[4]。由于傳統(tǒng)單一方法提取時(shí)間長(zhǎng)、效率低，本文采用超聲波酶解提取法，該方法污染小、時(shí)間短，能較完整提取生物活性大分子[5]。

純正鱈魚指鱈屬魚類，分為大西洋鱈魚（Ga?dus morhua）、格陵蘭鱈魚（Gadus ogac）和太平洋鱈魚（Gadus macrocephalus）[6]。阿拉斯加三面環(huán)海，是全球?yàn)閿?shù)不多能大量供應(yīng)多種深海魚類的產(chǎn)地[7]。研究利用胃蛋白酶對(duì)深海鱈魚皮的作用，制備可溶性膠原蛋白，切去膠原肽鏈端肽的交聯(lián)區(qū)，使酸性pH條件下膠原組織膨脹，溶解[8]。酶解鱈魚皮膠原蛋白具有獨(dú)特的保濕性能，抗氧化，減緩皮膚衰老[9]。超聲波可提高提取率，促進(jìn)酶活性，或者破壞酶結(jié)構(gòu)，使酶失活。本研究以阿拉斯加鱈魚魚皮為原料，采用超聲波輔助酶解條件，利用響應(yīng)面分析法分析，為膠原蛋白提取與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

阿拉斯加深海鱈魚皮，購(gòu)自大連市鴻運(yùn)魚皮加工廠；胃蛋白酶（1 200 U·g-1），羥脯氨酸，乙二胺四乙酸（EDTA），氯胺T，對(duì)二甲基氨基苯甲醛，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純（AR）。

1.2 主要儀器

THZ-82（A）氣浴恒溫振蕩器，購(gòu)自金壇市科析儀器公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外分光光度計(jì)，購(gòu)自上海天美科學(xué)儀器有限公司；超聲波儀，購(gòu)自上海生析超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取膠原蛋白[10]

冷凍阿拉斯加深海鱈魚皮先解凍，浸泡在10倍體積的NaCl溶液中，置于4℃冰箱冷藏2～3 h，去除雜蛋白。取處理后魚皮10 g，加入10 mL乳酸，0.65 mL胃蛋白酶（1 200 U·g-1）和2～3顆玻璃珠，在室溫下放入超聲波（180 W）中提取膠原蛋白，使蛋白酶和魚皮充分反應(yīng)[11]。一定時(shí)間后放入恒溫培養(yǎng)箱，恒溫一定時(shí)間。所得提取液在離心力560 N（10 000 r·min-1）下高速離心15 min，上層粘性液體加入NaCl至濃度2.5 mol·L-1，2 h后絮狀沉淀，再次以560 N（10 000 r·min-1）高速離心15 min，得到沉淀，置于透析袋中透析，透析內(nèi)外液均設(shè)為蒸餾水，用10%硝酸銀檢驗(yàn)透析外液無白色沉淀為止，將提取液進(jìn)行冷凍干燥得膠原蛋白成品[12]。為確定膠原蛋白最佳提取工藝，在前期研究基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)以超聲波提取時(shí)間、酶提取時(shí)間、酶解溫度、pH為因素的正交試驗(yàn)。

1.3.2 繪制羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

本文通過測(cè)得吸光度值，利用公式計(jì)算出膠原蛋白中羥脯氨酸含量，羥脯氨酸為膠原蛋白獨(dú)有氨基酸，此方法可計(jì)算出膠原含量[13]。

先用0.01 mol·L-1鹽酸溶解100 mg L-羥脯氨酸，加蒸餾水至100 mL以制備羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液，并于4℃冷藏貯存。再取儲(chǔ)存液10 mL，倒入100 mL容量瓶加蒸餾水定容，由于溶液常溫光照易分解，需現(xiàn)用現(xiàn)配，把標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為100 mg·L-1，得到羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液[14]。取8支試管，分別加標(biāo)準(zhǔn)工作液從1～4.5 mL每隔0.5 mL，之后加蒸餾水稀釋至100 mL。取各濃度標(biāo)準(zhǔn)液1 mL，再加入1 mL C6H8O7及1 mL氯胺T溶液，氧化10 min，加HClO4溶液1 mL，靜置10 min后置于65℃水浴鍋顯色反應(yīng)，加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛顯色劑1 mL，水浴顯色10 min后冷卻，在560 nm處測(cè)量吸光度（蒸餾水為空白對(duì)照）[15]。羥脯氨酸濃度為x軸，紫外分光光度計(jì)測(cè)得吸光度為y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程，見圖1。

圖1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of hydroxyproline

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.0501x+0.132，R2=0.999。

式中，x—羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度（μg·mL-1）。

1.3.3 鱈魚皮膠原蛋白提取液中羥脯氨酸含量的測(cè)定

將1.3.1制備的膠原蛋白提取液加至100 mL容量瓶?jī)?nèi)，再加入蒸餾水定容。取稀釋后1 mL溶液再加入50 mL蒸餾水稀釋。取上述溶液1 mL置于試管內(nèi)，加入檸檬酸緩沖液1 mL，氯胺T 1 mL，混合氧化10 min，之后加入HClO4溶液1 mL，靜置10 min。利用顯色劑在65℃水浴鍋顯色反應(yīng)，上述稀釋溶液中加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛顯色試劑1 mL，顯色10 min，靜置冷卻。利用紫外分光光度儀在560 nm處測(cè)量吸光度（蒸餾水為空白對(duì)照）[16]。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得樣品液中羥脯氨酸質(zhì)量濃度，再用公式得到羥脯氨酸得率：

式中，W—樣品中羥脯氨酸得率（%）；ρ—羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度（μg·mL-1）；V—提取液總體積（mL）；k—稀釋倍數(shù)；m—原料質(zhì)量（g）；n—換算系數(shù)（為0.1）。

成品得率（%）=冷凍干燥后膠原蛋白重量（g）/魚皮原重量（g）×100%°

1.3.4 單因素試驗(yàn)

通過預(yù)試驗(yàn)設(shè)定選取超聲波提取時(shí)間、胃蛋白酶提取時(shí)間、酶解溫度、pH 4個(gè)單因素水平。在pH 2.0、酶解溫度35℃、酶解提取時(shí)間7.5 h條件下，選取超聲波時(shí)間為2、2.5、3.0、3.5、4、4.5 h，測(cè)定并計(jì)算膠原蛋白提取率；在pH 2.0、酶解溫度35℃、超聲波提取時(shí)間3.5 h條件下，選取提取時(shí)間4、5、6、7、8、9 h，測(cè)定提取率；在超聲波提取時(shí)間3.5 h、酶解時(shí)間7.5 h、pH 2.0條件下，選取胃蛋白酶水解溫度25、30、35、40、45℃進(jìn)行單因素試驗(yàn)測(cè)定提取率；在超聲波提取時(shí)間3.5 h、酶解時(shí)間為7.5 h、提取溫度35℃條件下，pH分別選取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0進(jìn)行提取試驗(yàn)。每個(gè)水平平行3次取平均值。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取超聲波提取時(shí)間、酶解溫度、pH 3個(gè)因素為參考因素，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)（見表1），采用Design expert 8.0.6軟件處理數(shù)據(jù)，得到提取膠原蛋白的優(yōu)化工藝。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)3因素水平編碼Table 1 Codes and levels on three factors of Box-Behnken experimental

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用Excel 2007、Design expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲波提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

由圖2可知，隨超聲波提取時(shí)間延長(zhǎng)，提取率不斷增大，說明超聲波可增加提取率，縮短提取時(shí)間，但當(dāng)超聲波提取時(shí)間超過3.5 h后，提取率不變，說明膠原蛋白與胃蛋白酶間傳質(zhì)推動(dòng)力趨于零。

圖2 超聲波提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effects of supersonic extraction time on extraction rate of collagen

2.1.2 胃蛋白酶水解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

結(jié)果見圖3，酶解時(shí)間7.5 h最佳，繼續(xù)增加酶量，得率增加緩慢，不適宜增加更高酶量。

圖3 胃蛋白酶水解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effects of enzymatic time on extraction rate of collagen

2.1.3 酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

選取不同溫度條件下，探討溫度對(duì)膠原蛋白酶解提取效果的影響。結(jié)果見圖4，隨溫度提高，提取率不斷上升，在35℃時(shí)達(dá)最大，溫度繼續(xù)升高則提取率下降，說明酶活性被高溫抑制。結(jié)果說明，35℃是胃蛋白酶適宜溫度，其活性達(dá)最大。

圖4 酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.4 Effects of temperature on extraction rate of collagen

2.1.4 pH對(duì)膠原蛋白提取率的影響

調(diào)節(jié)不同pH測(cè)定對(duì)膠原蛋白提取率的影響，結(jié)果如圖5所示，在pH 2.0時(shí)提取率最佳，同時(shí)也適合胃蛋白酶的活性酸度范圍。

圖5 pH對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.5 Effects of pH on extraction rate of collagen

2.1.5 優(yōu)化正交試驗(yàn)

上述單因素試驗(yàn)可得出，膠原蛋白提取率與胃蛋白酶解時(shí)間關(guān)系較不明顯，與超聲波提取時(shí)間、pH、溫度關(guān)系影響較大。取超聲波提取時(shí)間、pH、提取溫度為影響因素，確定胃蛋白酶解時(shí)間7.5 h，每個(gè)因素取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化提取條件[17]。每組試驗(yàn)取10 mL膠原蛋白提取液，各組試驗(yàn)提取液按1.3.2方法測(cè)定吸光度，計(jì)算膠原蛋白提取率。結(jié)果見表2。

按照正交試驗(yàn)所得結(jié)果，分析3個(gè)因素水平對(duì)提取率影響程度分別為：超聲提取時(shí)間＞pH＞溫度；經(jīng)分析結(jié)果得出膠原蛋白提取最優(yōu)工藝A2C2B2，即pH 2.0、溫度35℃、超聲波提取時(shí)間3.5 h。

表2 L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of L9(33)'s orthogonal experiment

2.1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，選取超聲波提取時(shí)間（X1）、酶解溫度（X2）、pH（X3）3個(gè)影響因子，膠原蛋白提取率為響應(yīng)值，可得到試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表3。

表3 膠原蛋白提取工藝Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Results of Box-Behnken design and corresponding for collagen extraction

采用Design expert 8.0.6軟件對(duì)17組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸分析，可以得到pH、超聲波提取時(shí)間及酶解溫度對(duì)提取率影響的多元二次回歸方程：

檢驗(yàn)回歸方程有效性及3個(gè)單因素因子對(duì)鱈魚皮中膠原蛋白提取率的影響，對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析（見表4）。P＜0.0001表示有極顯著的差異，0.0001＜P＜0.01較為顯著差異，0.01＜P＜0.05有顯著差異。P值為0.1183不顯著，決定系數(shù)R2= 0.9875，表明超聲波提取時(shí)間、酶解溫度及pH等3個(gè)因子對(duì)鱈魚皮膠原蛋白提取率有98.75%影響?？梢钥闯?，此模型擬合度較適合分析鱈魚蛋白提取率，回歸方程可以表示3因素對(duì)響應(yīng)值函數(shù)關(guān)系。

由表4可知，回歸模型中X2的P＜0.0001，表明酶解溫度（X2）對(duì)膠原蛋白的提取率影響極其顯著。pH（X3）P值為0.0001～0.01，其對(duì)鱈魚蛋白提取率影響較為顯著。超聲波提取時(shí)間（X1）的P＞0.01也說明其顯著影響蛋白提取率，不如pH及酶解溫度影響明顯。X1X3和X2X3項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值有顯著影響，而X1X2沒有。二次項(xiàng)3個(gè)因素顯著性X22＞X32＞X12。顯示3個(gè)因子超聲波提取時(shí)間、酶解溫度、pH對(duì)鱈魚皮膠原蛋白提取影響相關(guān)聯(lián)，不是單因素影響的線性關(guān)系，通過數(shù)學(xué)建模可表示3因素對(duì)提取率的影響。

表4 提取工藝回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA for the regression equation describing the extraction process

由響應(yīng)面圖6～8可知，3個(gè)因子對(duì)響應(yīng)值的敏感程度，酶解溫度響應(yīng)曲面最陡峭，對(duì)蛋白提取率作用最顯著，其次是pH，再次是超聲波提取時(shí)間。通過使用軟件Design expert 8.0.6對(duì)回歸方程進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)而得到最優(yōu)工藝：在酶解時(shí)間7.5 h條件下，超聲波輔助提取時(shí)間3.5 h，pH 2.0，溫度35℃，膠原蛋白的模型最優(yōu)提取率達(dá)33.28%。利用數(shù)學(xué)建模得出模型條件，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，所得蛋白提取率為33.75%，與預(yù)測(cè)模型相差不大。實(shí)際試驗(yàn)操作結(jié)果與數(shù)學(xué)模型結(jié)果一致，說明擬合度良好，可以響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)得出工藝參數(shù)。

2.2 提取膠原蛋白純度測(cè)定

經(jīng)冷凍干燥后的膠原蛋白為淺黃色三維孔狀結(jié)構(gòu)，是一種含大量羥基的糖蛋白，通過氫鍵可與水分子結(jié)合，吸水性極強(qiáng)[18]。

取10 mg冷凍干燥后的膠原蛋白樣品，加入20 mL濃度為6 mol·L-1鹽酸溶解，測(cè)定特征氨基酸羥脯氨酸質(zhì)量濃度，3次平行試驗(yàn)取平均值，計(jì)算膠原蛋白提取率（%）=干燥后膠原質(zhì)量（mg）/干燥前膠原質(zhì)量（mg）×100%=33.75%。

圖6 pH 2.0時(shí)超聲波提取時(shí)間和溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.6 Effects of supersonic extraction time and temperature on extraction rate of collagen with pH 2.0

圖7 超聲波提取時(shí)間3.5 h時(shí)pH和溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.7 Effects of pH and temperature on extraction rate of collagen with supersonic extraction time 3.5 h

圖8 溫度為35℃時(shí)超聲波提取時(shí)間和pH對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.8 Effects of supersonic extraction time and pH on extraction rate of collagen with temperature 35℃

2.3 膠原蛋白光譜掃描

取適量稀醋酸溶解少量膠原蛋白提取液，置于紫外分光光度計(jì)中，以稀醋酸作為空白對(duì)照，在近紫外區(qū)200～300 nm進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖9所示。

由圖9可知，在近紫外區(qū)200～300 nm進(jìn)行光譜掃描，其最大特征吸收波長(zhǎng)為226 nm，符合膠原蛋白紫外吸收特征[19]。

圖9 膠原蛋白的紫外光譜Fig.9 UV absorption spectrum of collagen

3 討論與結(jié)論

目前對(duì)膠原蛋白提取液進(jìn)行鹽析、透析多采用提取試劑溶解經(jīng)NaCl鹽析成的絮狀沉淀，透析外液也用提取試劑進(jìn)行透析，本試驗(yàn)用蒸餾水作為溶解液和透析外液，節(jié)約成本。在提取時(shí)加入少量玻璃珠于提取試劑中，加速塊狀魚皮溶解速度。

超聲波產(chǎn)生微聲流能加快傳質(zhì)擴(kuò)散，產(chǎn)生空化、震蕩效應(yīng)，活化酶分子構(gòu)象及催化部位。本試驗(yàn)利用超聲波和胃蛋白酶共同作用提取膠原蛋白，所用時(shí)間為3.5 h，與單獨(dú)酶解所需時(shí)間23 h相比，能夠顯著縮短提取時(shí)間。

本研究將響應(yīng)曲面法運(yùn)用于優(yōu)化鱈魚皮膠原蛋白提取工藝。經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化后的膠原蛋白提取最佳工藝條件為：超聲波輔助提取時(shí)間3.5 h、pH 2.0、溫度35℃、酶解時(shí)間7.5 h。此工藝下建模理論提取率為33.28%，實(shí)際試驗(yàn)得出提取率為33.75%，誤差小。因此，可采用此模型對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各因素對(duì)膠原蛋白提取率的影響分別為：超聲波輔助提取時(shí)間＞pH＞溫度＞酶解時(shí)間。研究結(jié)果顯示，超聲波輔助酶法提取膠原蛋白時(shí)間短、得率高。如何將多種提取方法結(jié)合使用最大限度縮短提取時(shí)間并提高得率，尚待深入研究。

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Optimization of cod skin collagen extrating conditions by ultrasonic respose surface methodology

WANG Xi1,ZHONG Yaoguang1,ICHIKAWA Hisashi2(1. School of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2. Faculty of Fisheries,Nagasaki University,Nagasaki 852-8043,Japan)

Using fresh Alaska abysmal sea cod skin as raw material,the use of response surface methodology(RSM)optimized the ultrasonic extraction of collagen fast process.It could get the factor order by using single factor experiment.pH,temperature and the supersonic extraction time were chosen as influencing factors.The extraction rate of collagen was selected as response value.The mathematical model was established by Box-Behnken central composite design.The results showed that the optimum conditions were pH 2.0,temperature 35℃,supersonic extraction time 3.5 h,the decomposition time of enzyme 7.5 h, extraction rate of collagen was 33.75%.

response surface;ultrasonic wave;collagen;cod

TS254.9；S965.321

A

1005-9369（2014）07-0117-07

時(shí)間2014-7-4 17:27:09 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140707.0843.011.html

王希,鐘耀廣,市川壽.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波快速提取鱈魚皮中膠原蛋白的工藝研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(7):117-123.

Wang Xi,Zhong Yaoguang,Ichikawa Hisashi.Optimization of cod skin collagen extrating conditions by ultrasonic respose surface methodology[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(7):117-123.(in Chinese with English abstract)

2014-04-13

上海市科委工程中心建設(shè)項(xiàng)目（11DZ2280300）

王希（1987-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苁称?。E-mail:195184808@qq.com

*通訊作者：鐘耀廣，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槭称钒踩c功能食品。E-mail：ygzhong@shou.edu.cn