任曉峰，竇秀靜,郝雅環(huán)，孫劉妹，魏小寧

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

豬輪狀病毒DN30209株VP4全長蛋白表達(dá)及多抗制備和鑒定

任曉峰，竇秀靜,郝雅環(huán)，孫劉妹，魏小寧

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

為開展豬輪狀病毒（PRV）及其VP4蛋白相關(guān)特性研究，參照GenBank所收錄的豬輪狀病毒JL94、OSU等株序列設(shè)計(jì)一對特異性引物，從實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的豬輪狀病毒DN30209株擴(kuò)增約2 330 bp VP4全長基因，并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒VP4-pMD18-T。重組質(zhì)粒經(jīng)測序、序列比對及分析。結(jié)果表明，DN30209株VP4全基因長2 331 bp，與參考株JL94的核苷酸同源性為99.7%，氨基酸同源性為99.5%。將VP4基因連接到pGEX-6P-1原核表達(dá)載體中，構(gòu)建并篩選出陽性原核表達(dá)載體重組質(zhì)粒VP4-pGEX-6P-1。陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta宿主菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白，融合蛋白大小約為112 ku，與預(yù)期大小相符?；厥?、純化并復(fù)性該蛋白，將其作為免疫原免疫大白兔，制備兔抗PRV VP4全長蛋白多克隆抗體，間接ELISA測定多抗效價(jià)到1∶105，間接免疫熒光（IFA）和免疫印跡（Western blot）檢測表明該多抗均可與PRV具有很好的抗原抗體反應(yīng)性，為豬輪狀病毒研究提供有效實(shí)驗(yàn)材料。

豬輪狀病毒；克?。辉吮磉_(dá)；抗體制備

豬輪狀病毒（Porcine rota virus，PRV）屬于呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，是幼年仔豬發(fā)生腹瀉的主要病原之一。輪狀病毒無囊膜，其病毒顆粒結(jié)構(gòu)包括三層蛋白，最內(nèi)層包括VP2、VP1和VP3，構(gòu)成病毒核心，VP6到VP2產(chǎn)生第二層，最外層主要由兩種蛋白構(gòu)成，包括VP4和VP7[1]。VP4是病毒生命周期中最重要的蛋白，包括病毒-受體結(jié)合以及病毒繁殖。VP4蛋白通過蛋白水解酶水解，可裂解為VP8和VP5，故該蛋白又稱蛋白酶-敏感蛋白（Protease-sensitive protein），這一過程對病毒進(jìn)入細(xì)胞尤為重要[2]。

PRV粒子表面有三種重要的抗原，即群抗原VP6、中和抗原VP7以及血凝素抗原VP4。其中，VP4抗原具有血凝作用，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原[3-4]。由于其表面蛋白VP7與VP4的高度可變性和均可獨(dú)立誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的特點(diǎn)，分別建立依據(jù)蛋白VP7和VP4的兩個(gè)獨(dú)立的血清型分類系統(tǒng)，即由VP7決定的“G”型和由VP4決定的“P”型[5]。VP4由RV基因片段4編碼，由776個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量88 ku，占病毒蛋白總量的1.5%，屬外衣殼蛋白。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，VP4以二聚體形式存在[6]。

VP4蛋白是重要的生物學(xué)功能性蛋白，①其能介導(dǎo)該病毒與易感細(xì)胞系的吸附過程，賦予病毒致病性。VP4經(jīng)胰蛋白酶作用的裂解位點(diǎn)在aa241或aa247處，分別裂解為兩條長度不等的肽段VP8和VP5。其中，VP8具有吸附宿主細(xì)胞的作用；VP5主要與病毒穿入宿主細(xì)胞有關(guān)[7]；②促進(jìn)空斑形成，在胰酶作用下，其能促進(jìn)體外培養(yǎng)細(xì)胞形成空斑，說明VP4與病毒毒力密切相關(guān)。根據(jù)VP4抗原性不同，可將輪狀病毒分為不同的血清型（P型），至今已知有21個(gè)不同的P血清型[8]；③VP4還有中和抗原作用，自然感染后，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[9]。

目前，對豬輪狀病毒VP4研究較多，但對豬輪狀病毒VP4蛋白全長的表達(dá)仍未見報(bào)道，而VP4蛋白全長多抗是試驗(yàn)研究重要材料之一。本試驗(yàn)利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)VP4的全長蛋白，并制備兔源的多克隆抗體，通過免疫印跡分析，該多抗能與PRV產(chǎn)生良好抗原抗體反應(yīng)，有效的識別病毒VP4天然蛋白，通過間接免疫熒光分析，該蛋白表達(dá)在細(xì)胞膜上。該多克隆抗體可為PRV研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和細(xì)胞

豬輪狀病毒（PRV）DN30209株由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)分子病原學(xué)與公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室分離并保存；恒河猴胚胎腎細(xì)胞（MA104）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)分子病原學(xué)與公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 菌株與載體

大腸桿菌菌株JM109、Rossetta由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)分子病原學(xué)與公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T購自于大連TaKaRa公司；原核表達(dá)載體pGEX-6P-1由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)分子病原學(xué)與公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑

RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄酶（購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司）；PCR試劑盒、DNA純化膠回收試劑盒；T4DNA連接酶及其緩沖液、dNTPs、LA Taq DNA聚合酶、BamH I和Sal I、LA Tag DNA聚合酶、T4DNA連接酶（均購自TaKaRa公司）；PCR Marker DL5000（購自上海鼎國生物公司）；小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒（購自于索萊寶公司）；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（購自武漢博士德公司）；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（購自GIBCO公司）；DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量trans plus II（購自北京全氏金公司）；蛋白質(zhì)Marker（中）（購自MBI公司）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動物

體重約為2～2.5 kg·只-1的雌性新西蘭大白兔，購自哈爾濱市某實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 方法

1.2.1 病毒的培養(yǎng)

將實(shí)驗(yàn)室保存的PRV病毒與30 μg·mL-1胰蛋白酶按1∶1混合，37℃孵育1 h，取6孔板長至80%的MA104細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，1×PBS洗3次，按原培養(yǎng)液的10%量加入胰酶處理過的病毒液，37℃吸附1h，每隔15 min輕搖1次，加入維持液（不含血清的DMEM），并加入胰酶使終濃度為3 μg·mL-1，37℃5%CO2培養(yǎng)，逐日觀察CPE。24 h后出現(xiàn)明顯的CPE，待細(xì)胞脫落80%～90%收毒，反復(fù)凍融3次，整個(gè)試驗(yàn)過程設(shè)置細(xì)胞對照。

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增VP4基因

根據(jù)GenBank中JL94和OSU等毒株，利用Oligo設(shè)計(jì)一對引物，上游VP4-1：GGATCCGGCTA TAAAATGGCTTC（BamH I），下游VP4-2：GTCGAC TGACTCTAGACACTGCTTA（Sal I）由博士生物工程技術(shù)有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段2 331 bp。取經(jīng)反復(fù)凍融3次的PRV細(xì)胞培養(yǎng)物200 μL，按照提取RNA試劑盒提取RNA，通過cDNA合成試劑盒，進(jìn)行反轉(zhuǎn)，采用20 μL反應(yīng)體系：M-MuLV 1 μL；5×RT-PCR Buffer 4 μL；dNTP（10 mmol·L-1）1 μL；RNA 5 μL；下游引物VP4-2 1 μL；Rnase Inhibitor 0.5 μL；DEPC水7.5 μL；反應(yīng)程序：30℃10 min；42℃60 min；95℃5 min。以該cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增該目的片段，采用50 μL PCR反應(yīng)程序：10×LA Taq buffer 5 μL；LA Taq 0.3 μL；dNTP（2.5 mmol·L-1）4 μL；cDNA 4 μL；VP4-1 1 μL；VP4-2 1 μL；ddH2O 34.7 μL；94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；52.8℃退火30 s；72℃延伸3 min；35個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 重組質(zhì)粒VP4-pMD18-T質(zhì)粒的構(gòu)建

將純化的VP4 PCR產(chǎn)物與pMD18-T按照說明書進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，挑菌，搖菌，經(jīng)PCR及雙酶切鑒定得到陽性重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒送測序公司測序并命名為VP4-pMD18-T。

1.2.4 VP4-pGEX-6P-1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將VP4-pMD18-T與pGEX-6P-1分別用BamH I，Sal I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化，按照1∶7的濃度比通過T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化，挑菌，搖菌，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定得到陽性重組質(zhì)粒并命名為VP4-pGEX-6P-1。

1.2.5 重組VP4-pGEX-6P-1蛋白表達(dá)

將VP4-pGEX-6P-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落接種于含Amp+的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度1 mmol·L-1，37℃條件誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)收集小時(shí)樣，共6 h。將所收集的菌液4℃、12 000 r·min-1離心5 min收集沉淀，再用30 μL PBS懸起后加入等量2×SDS凝膠上樣緩沖液，沸水煮10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6 VP4蛋白純化及復(fù)性

將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液超聲裂解處理，SDS-PAGE蛋白電泳，將以包涵體形式表達(dá)的目的蛋白帶切膠純化，置于EP管中，加入適量的PBS，反復(fù)凍融3次，10 000 r·min-1離心10 min，收集上清，鑒定切膠結(jié)果。

將蛋白液置于處理過的透析袋中，置于復(fù)性液中1 h，換復(fù)性液放置2 h，1×TE buffer中4 h或過夜，20%PEG8000濃縮，測定蛋白濃度[10]。

1.2.7 重組蛋白免疫大白兔

將復(fù)性后的蛋白液作免疫原，首免：復(fù)性后的蛋白液（約2 mg）[11]與等體積的完全弗氏佐劑乳化充分，家兔背部皮下多點(diǎn)注射。10 d后二免，不完全弗氏佐劑與等體積的蛋白乳化，經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射。7 d后三免，三免后3 d，耳緣靜脈取血，測抗體效價(jià)[12-14]。效價(jià)達(dá)到一定值后，耳緣靜脈直接注射約1 mg蛋白液，6 d后頸動脈取血，將血液置于37℃溫箱2 h，轉(zhuǎn)移至4℃過夜，4℃10 000 r·min-1離心20 min，收集血清，分裝保存。

1.2.8 抗體效價(jià)檢測及生物活性檢測

1.2.8.1 間接ELISA檢測兔抗VP4-pGEX-6P-1蛋白血清效價(jià)

將純化的VP4蛋白為抗原包被酶標(biāo)板，1 μg·孔-1，同時(shí)設(shè)2個(gè)副孔。5%脫脂乳4℃封閉過夜，PBST洗3次，每次5 min，將待測血清以10倍比稀釋，同時(shí)將陰性血清作為陰性對照組以同樣方法稀釋，37℃孵育1 h，PBST洗3次后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000）37℃孵育1 h，PBST洗3次，經(jīng)底物OPD顯色后，2 mmol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定OD490 nm處數(shù)值。

1.2.8.2 Western blot檢測多抗的生物活性

刮取PRV感染的細(xì)胞及未感染的對照組細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解20 min，注射器反復(fù)吹打20次，4℃10 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，加入等量的 2×上樣 buffer，沸水煮 10 min，SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜，用含5%脫脂乳的PBST，4℃封閉過夜，以制備的抗VP4多抗血清為一抗（1∶1 000稀釋），以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗（1∶3 000稀釋），DAB顯色。

1.2.8.3 間接免疫熒光

傳MA104細(xì)胞于24孔板待長至80%，100 TCID50接種PRV，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對照組，感染24 h后，預(yù)冷PBS洗3次，加入350 μL預(yù)冷的多聚甲醛室溫固定30 min，棄液加入350 μL預(yù)冷的0.1 mol·L-1甘氨酸，室溫5 min，PBS洗3次，兔抗VP4蛋白多抗作為一抗1∶200稀釋，37℃孵育45 min，PBS洗3次，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG1∶200稀釋37℃避光孵育30min。PBS洗3次，熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP4全長基因的擴(kuò)增及VP4-pMD18-T重組質(zhì)粒酶切鑒定

RT-PCR方法擴(kuò)增的PRV VP4全長基因產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠中出現(xiàn)清晰的目的條帶，大約為2 330 bp（如圖1），與預(yù)期的片段大小2 331 bp相符。對VP4-pMD18-T質(zhì)粒使用限制性內(nèi)切酶BamH I、Sal I進(jìn)行雙酶切后，獲得兩段約為2 692和2 331 bp的片段，鑒定結(jié)果（如圖1），與預(yù)測相符。

圖1 PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒VP4-pMD18-T和VP4-pGEX-6P-1酶切結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplifying VP4 gene and double digestion of VP4-pMD18-T and VP4-pGEX-6P-1 plasmid

2.2 VP4全基因測序比對

為保證目的片段的準(zhǔn)確性，將VP4-pMD18-T測序結(jié)果表明，克隆的VP4全基因片段大小為2 331 bp，含有完整的ORF2331 bp，編碼777個(gè)氨基酸。由圖2a可知，分離株DN30209與JL94、K71的核苷酸同源性分別為99.7%、99.4%、但與其他分離株的核苷酸同源性均不高于71%。由圖2b可知，分離株DN30209與JL94、K71的氨基酸同源性分別為99.5%、99.0%、但與其他分離株的核苷酸同源性均不高于82%。由圖3可知，通過該分離株和其他20個(gè)VP4基因型輪狀病毒毒株VP4編碼區(qū)核苷酸構(gòu)建的系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，分離株DN30209與VP4型毒株JL94、K71處在一個(gè)分支。

2.3 重組質(zhì)粒VP4-pGEX-6P-1的鑒定

以含重組質(zhì)粒的菌落為模板進(jìn)行VP4片斷擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠（含EB）中進(jìn)行電泳，得到大小約2 331 bp特異性條帶，與預(yù)計(jì)長度相符。VP4-pGEX-6P-1質(zhì)粒使用限制性內(nèi)切酶BamH I、Sal I進(jìn)行雙酶切后，獲得兩段約為4 984和2 331 bp的片段，鑒定結(jié)果（如圖1），與預(yù)測大小相符。

圖2 分離株DN30209和部分豬輪狀病毒毒株VP4基因編碼區(qū)氨基酸序列同源性分析Fig.2 Homology analysis based on VP4 gene amino acid sequence of porcine rotavirus isolated DN30209 strain

圖3 DN30209 VP4基因進(jìn)化樹分析結(jié)果Fig.3 A phylogenetic tree was constructed based on these PRV VP4 nucleotide sequences

2.4 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化

2.4.1 VP4-pGEX-6P-1蛋白表達(dá)的SDS-PAGE電泳分析

VP4-pGEX-6P-1與空載體pGEX-6P-1轉(zhuǎn)化Rosetta，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)10% SDS-PAGE鑒定（如圖4），在SDS-PAGE電泳凝膠中出現(xiàn)112 ku（融合蛋白）大小的條帶。標(biāo)簽大小約為26 ku，由此推導(dǎo)出表達(dá)的與預(yù)期的85.6 ku結(jié)果相符。超聲裂解表明蛋白主要以包涵體的形式存在（如圖4）。

圖4 重組菌pGEX-6P-1-VP4誘導(dǎo)表達(dá)及純化的SDS-PAGE分析鑒定結(jié)果Fig.4 Identification results of induced and purified proteins VP4-pGEX-6P-1 via SDS-PAGE analysis

2.4.2 融合蛋白回收純化的鑒定

切膠純化融合VP4目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE膠鑒定，位置大小正確，條帶單一，結(jié)果如圖4所示。

2.5 多克隆抗體效價(jià)檢測

以純化的VP4融合蛋白作為抗原包被ELISA反應(yīng)板，分別與采集的多克隆抗體為一抗，同時(shí)以未免疫的兔血清為陰性對照，1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG為二抗，效價(jià)以實(shí)驗(yàn)組的OD490（P）/陰性血清對照組的OD490（N）＞2作為判定陽性的標(biāo)準(zhǔn)，檢測多抗血清的效價(jià)為1∶105，結(jié)果見圖5。

圖5 抗PRV VP4全長蛋白抗體效價(jià)分析Fig.5 Antibody titer of antibody against PRV VP4 complete protein

2.6 Western blot分析

病毒及細(xì)胞對照蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到NC膜上進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示，與病毒反應(yīng)NC膜上出現(xiàn)86 ku條帶，與蛋白反應(yīng)NC膜上有一條約112 ku的條帶（見圖6），目的大小與預(yù)期相符。

圖6 VP4多抗與豬輪狀病毒W(wǎng)estern blot結(jié)果Fig.6 Western blot analysis result VP4 and poreine votavirus

Western blot結(jié)果顯示，此抗血清能夠特異性識別PRV VP4蛋白，而與細(xì)胞對照組無反應(yīng)。

2.7 間接免疫熒光

間接免疫熒光結(jié)果證實(shí)，用兔抗VP4多抗血清檢測感染PRV的MA104細(xì)胞可見有特異性的綠熒光信號，而正常細(xì)胞對照則沒有檢測到綠熒光，證明此多抗血清能夠用于PRV的特異性檢測（見圖7）。

圖7 PRV感染MA104細(xì)胞的免疫熒光檢測抗體特異性Fig.7 Immunofluorescence analysis of PRV infected MA104 cell

3 討論與結(jié)論

豬輪狀病毒感染普遍流行，主要造成仔豬腹瀉，影響豬生長發(fā)育，且用于人的輪狀病毒疫苗大部分毒株來自動物源。因此，控制動物輪狀病毒的感染，對保證畜牧業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義，對于公共衛(wèi)生安全也具有重要意義[15-17]。

田小艷研究報(bào)道輪狀病毒VP4基因能夠抑制病毒在MA 104細(xì)胞上生長，但是VP4基因?qū)σ让该舾?，通過胰酶可使VP4基因特異性裂解為VP8 和VP5，使病毒具有感染性，易在細(xì)胞上生長[18]。VP4是豬輪狀病毒最重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，但其全長蛋白表達(dá)至今仍未見報(bào)道，本研究從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)分子病原學(xué)與公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室分離的中國株豬輪狀病毒DN30209株中克隆VP4基因全長，測序后，經(jīng)過系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹及核苷酸、氨基酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn)：DN30209株的VP4基因核苷酸序列與JL94、K71處于同一分支，其中與JL94株的同源性最高，達(dá)到99.7%，次之，與K71同源性為99.4%，但與其他分離株的核苷酸同源性均不高于71%；另外，其與JL94、K71的氨基酸序列同源性分別為99.5%、99.0%、但與其他分離株的核苷酸同源性均不高于82%。這些發(fā)現(xiàn)可為我國豬輪狀病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查和免疫預(yù)防提供重要理論依據(jù)。

本試驗(yàn)構(gòu)建PRV VP4全長的VP4-pMD18-T重組質(zhì)粒及VP4-PGEX-6P-1原核表達(dá)載體重組質(zhì)粒，在最適條件下，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌內(nèi)成功表達(dá)VP4全長蛋白，對表達(dá)的產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，體外及動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性和免疫原型。制備的多克隆抗體經(jīng)ELISA、Western blot、IFA實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有較好生物活性。因此，VP4蛋白表達(dá)可為今后研究基因工程苗和診斷方法等提供理想材料。RV不同毒株基因組序列之間存在較大差異，是由于輪狀病毒基因之間存在明顯“漂移”和“轉(zhuǎn)變”現(xiàn)象，導(dǎo)致其血清型的多型性。當(dāng)兩個(gè)不同血清型的毒株感染同一宿主細(xì)胞時(shí)，基因片段之間相互作用，在轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程中發(fā)生交換，交叉或者重排，可引起病毒的血清型變異[19]。由于國際畜產(chǎn)品貿(mào)易的發(fā)展，導(dǎo)致PRV新的血清型出現(xiàn)幾率明顯增加。因此，及時(shí)檢測PRV流行狀況，尤其是PRV流行株血清型變化情況，可為預(yù)防PRV提供有效技術(shù)支撐，對疫苗研究和使用提供理論依據(jù)。

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Expression VP4 complete protein and polyclonal antibodies preparation or detection of porcine rotavirus DN30209 strain/

REN Xiaofeng,DOU Xiujing,HAO Yahuan,SUN Liumei,WEI Xiaoning(School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

To study porcine rotavirus(PRV)VP4 protein levels related experiments,we refered to GenBank PRV JL94,OSU strains sequences,designed a pair of specific primers,the complete length of VP4 gene about 2 330 bp was cloned from the separation strain of DN30209 of our lab.Expanding product was constructed into a recombinant plasmid VP4-pMD18-T successfully.By sequencing,the sequence alignment and analysis,the results showed that the VP4 gene complete length of DN30209 was 2 331 bp,compared with JL94 strains,nucleotide homology was 99.7%,amino acid homology was 99.5%.The VP4 gene was connected with prokaryotic expression vector pGEX-6P-1,constructed andscreened the positive prokaryotic expression vector recombinant plasmid,marked as VP4-pGEX-6P-1. Following,positive recombinant plasmid was transformed into Rosetta competent cell,by IPTG induction,we have got the expression of recombinant proteins in the form of inclusion body,the fusion protein size is about 113 ku,consistent with the expected size.The protein Retrieved and purified,was used as immunogen to the white rabbit,and then,rabbit anti-VP4 protein polyclonal antibody was preparated,and detected biological activity.The results showed that:the titer of polyclonal antibody was approximately 1∶105,moreover,the polyclonal antibody,which has a good antigen-antibody reactivity with PRV,are available for IFA and WB,so,the PRV VP4 polyclonal antibody is an effective experimental material for porcine rotavirus research.

PRV;clone;prokaryotic expression;antibody preparation

S858

A

1005-9369（2014）12-0010-08

時(shí)間2014-12-29 8∶58∶54 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20141229.0858.002.html

任曉峰,竇秀靜,郝雅環(huán),等.豬輪狀病毒DN30209株VP4全長蛋白表達(dá)及多抗制備和鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45 (12):10-17.

Ren Xiaofeng,Dou Xiujing,Hao Yahuan,et al.Expression VP4 complete protein and polyclonal antibodies preparation or detection of porcine rotavirus DN30209 strain[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(12):10-17.(in Chinese with English abstract)

2014-03-11

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31300758;31340003）；“十二五”國家科技支撐項(xiàng)目（2013BAD12B04）；哈爾濱科學(xué)技術(shù)局項(xiàng)目（RC2012XK002003）；中國教育部重點(diǎn)項(xiàng)目（212038）

任曉峰（1974-2014），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)與分子病毒學(xué)。E-mail∶renxf@neau.edu.cn