張留燕，黃英子，劉延琳,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程中心，陜西 楊凌 712100）

利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析釀酒酵母的遺傳多樣性

張留燕1，黃英子1，劉延琳1,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程中心，陜西 楊凌 712100）

為研究本土釀酒酵母的種內(nèi)多態(tài)性，以及本土野生酵母與商業(yè)酵母之間的差異性，本實(shí)驗(yàn)采用4個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記（ScAAT1、YOR267C、C11、YPL009C）分析18株商業(yè)酵母和28株陜西涇陽(yáng)分離的野生釀酒酵母的遺傳多樣性，利用PopGen32進(jìn)行遺傳參數(shù)的分析。結(jié)果表明：4個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)出66個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)為16～18個(gè)；平均多態(tài)信息含量0.862 3，均為高多態(tài)位點(diǎn)；46株菌表現(xiàn)出39種基因型，分辨率為98.94%；觀測(cè)雜合度0.478 3～0.658 5。野生酵母和商業(yè)酵母均具有豐富的遺傳多樣性，兩個(gè)群體各具有自己獨(dú)特的等位基因，且兩者在聚類圖中有較清晰的界線。

微衛(wèi)星；商業(yè)酵母；本土釀酒酵母；遺傳多樣性

釀酒酵母是葡萄酒釀造中起最主要作用的微生物。它不僅決定葡萄醪發(fā)酵的成敗，而且對(duì)葡萄酒最終產(chǎn)品的產(chǎn)量、質(zhì)量及產(chǎn)品特色的形成都起到至關(guān)重要的作用。釀酒酵母的多樣性和獨(dú)特性，對(duì)葡萄酒的感官特性有重要貢獻(xiàn)[1]。采用分子技術(shù)對(duì)釀酒酵母進(jìn)行分類鑒定及多樣性研究是開(kāi)發(fā)和利用酵母菌資源的基礎(chǔ)，是選育優(yōu)良釀酒酵母菌種的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。

微衛(wèi)星是DNA短串聯(lián)重復(fù)序列（1～6個(gè)堿基重復(fù)），表現(xiàn)出重復(fù)次數(shù)的變異，這些序列廣泛存在于真核生物、原核生物[2]和病毒[3]基因組中。微衛(wèi)星表現(xiàn)出相同物種的個(gè)體之間實(shí)質(zhì)水平的多態(tài)性，廣泛用于父權(quán)否定測(cè)試[4]、法醫(yī)學(xué)[5]和不同真核生物的分子分型，如葡萄品種[6]和病原酵母（Candida albicans）[7]等。微衛(wèi)星標(biāo)記具有保守性好、高度多態(tài)、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)常在遺傳圖譜或群體遺傳的研究中用做遺傳標(biāo)記[8]。

Perez等[9]在釀酒酵母的基因組DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索二核苷酸和三核苷酸串聯(lián)重復(fù)，從中選取10個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行分析，證明微衛(wèi)星是一個(gè)分析釀酒酵母種群基因組的強(qiáng)大且靈活的工具。進(jìn)而幾位作者提出用于釀酒酵母分型的微衛(wèi)星位點(diǎn)組合[9-12]。多個(gè)研究表明，與隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、Interdelta等相比，微衛(wèi)星表現(xiàn)出較優(yōu)的分型效果[13-15]。采用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)釀酒酵母的分布和種群結(jié)構(gòu)塑造中地理、生態(tài)以及人類所發(fā)揮的作用進(jìn)行研究的報(bào)道也越來(lái)越多[16-18]。目前采用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)我國(guó)釀酒酵母的研究極其缺乏，本實(shí)驗(yàn)采用4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)28株本土野生酵母和18株商業(yè)酵母進(jìn)行基因分型，分析其遺傳多樣性，并對(duì)野生酵母和商業(yè)酵母兩個(gè)群體表現(xiàn)出來(lái)的差異進(jìn)行討論，為研究我國(guó)酵母資源多樣性及酵母選育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與引物

1.1.1 供試菌株

供試菌株包括商業(yè)酵母18株（BDX、CLIB2047、T306、R-HST、K1、Lalvin、Syrah、RA17、71B、W15、GRE、QA23、D47，法國(guó)Lallemand公司；F10、X16、VL1，法國(guó)Lafford公司；XR，法國(guó)Lamothe-Abiet公司；DSM，德國(guó)微生物菌種保藏中心）和2009年陜西涇陽(yáng)小白玫瑰葡萄發(fā)酵過(guò)程中分離的本土釀酒酵母28株（02y14、111y3、111y9、112y1、112y4、112y14、14w11、14w14、 173y1、173y4、173y7、173y8、173y10、173y15、174y1、174y5、174y15、181y1、181y2、181y3、181y4、181y6、181y10、182y5、182y12、23w12、23w13、23w15）。

1.1.2 微衛(wèi)星引物

本實(shí)驗(yàn)所采用的4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)信息見(jiàn)表1。

表1 微衛(wèi)星引物位點(diǎn)基本信息Table 1 Characteristics of four microsatellite loci tested in this study

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

將菌株在YPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，采用石英砂破壁法提取DNA[21]。

1.2.2 基因組DNA的PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系：總體積25μL，包含10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，0.5μmol/L引物，1.25U Taq DNA聚合酶，模板DNA 10～250 ng。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃、4 min；94℃、30 s，53℃、30 s，68℃、1 min，34個(gè)循環(huán)；68℃、10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè)及分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后，使用ABI 3730DNA測(cè)序儀以GeneScan ROX500作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，GeneMapper v3.2分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小。小數(shù)部分采取四舍五入的處理方法，在比較菌株的微衛(wèi)星基因型計(jì)算等位基因時(shí)，1核苷酸的差異不被認(rèn)為是不同的[22]。根據(jù)每個(gè)個(gè)體的條帶確定基因型，利用PopGen32軟件[23]統(tǒng)計(jì)微衛(wèi)星基因座的等位基因數(shù)（number of alleles，Na）、等位基因頻率（frenquencies of alleles，F(xiàn)a）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles，Ne）、觀測(cè)雜合度（observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）、遺傳分化系數(shù)（coefficient of genetic differentiation，F(xiàn)st）等。用NTsys軟件構(gòu)建基于每對(duì)菌株的Jaccard相似性系數(shù)的非加權(quán)算術(shù)平均數(shù)（unw eighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星多態(tài)性和遺傳多態(tài)性

46株釀酒酵母ScAAT1、YOR267C、C11、YPL009C 4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分型共檢測(cè)到66個(gè)等位基因，在S288C基因組中擁有最長(zhǎng)的TAA基元的ScAAT1，表現(xiàn)出最高的等位基因多樣性，檢測(cè)到18個(gè)等位基因。YOR267C、C11和YPL009C表現(xiàn)出稍微低一點(diǎn)的遺傳多態(tài)性，均有16個(gè)等 位基因。如果考慮較小和較大等位基因之間大小的差異，YOR267C有最顯著的188 bp的差異，這與前人研究相同[19]。ScATT1、YOR267C和C11最大和最小等位基因相差分別83、64、44 bp。野生酵母菌株111y9在ScAAT1和YPL009C兩個(gè)位點(diǎn)均未檢測(cè)到條帶，還有4株菌（174y15、181y2、181y4、181y6）在YPL009c位點(diǎn)未檢測(cè)到目的帶。4個(gè)位點(diǎn)的基因型數(shù)目分別為21、19、23、18種，46株菌共表現(xiàn)出39種基因型，分辨率[24]為98.94%。

ScAAT1、YOR267C、C11、YPL009C 4個(gè)位點(diǎn)多態(tài)信息含量分別為0.860 2、0.869 3、0.852 9、0.866 7。依PIC判斷標(biāo)準(zhǔn)[25]：PIC＜0.25為低度多態(tài)，0.25≤PIC＜0.5為中度多態(tài)，PIC≥0.5為高度多態(tài)，故4個(gè)位點(diǎn)均為高多態(tài)位點(diǎn)。

表2 46個(gè)供試菌株的多樣性分析結(jié)果Table 2 Statistical analysis for genetic diversity of 46 S. cereviase strains

如表2所示，商業(yè)酵母中，ScAAT1和YPL0 09C兩個(gè)位點(diǎn)雜合率高，YOR267C位點(diǎn)雜合率最低。野生酵母中，4個(gè)位點(diǎn)雜合度差異較小，與商業(yè)酵母相反，YOR267C和C11表現(xiàn)出雜合率稍高于另兩個(gè)位點(diǎn)，除C11外，3個(gè)位點(diǎn)的雜合度均高于Legras中[19]報(bào)道的雜合度。雜合度反應(yīng)群體的遺傳一致性，雜合度越高，群體的遺傳一致性就越低，其遺傳多樣性越高，由此說(shuō)明我國(guó)本土酵母包含遺傳信息的豐富程度較好。將所有菌株進(jìn)行整體分析，ScAAT1和YPL009C兩個(gè)位點(diǎn)雜合率較高，4個(gè)位點(diǎn)平均雜合率為0.592 0。

圖1 商業(yè)酵母和野生酵母4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因及等位基因頻率Fig.1 Alleles of four microsatellite loci and their frequencies in S. cerevisiae from commercial wine strains and indigenous yeasts

如圖1所示，每個(gè)位點(diǎn)均出現(xiàn)商業(yè)酵母和野生酵母群體特有的等位基因，商業(yè)酵母的特有等位基因較多，7～11個(gè)；野生酵母特有等位基因很少，1～3個(gè)。每個(gè)位點(diǎn)片段最小的一個(gè)等位基因均為商業(yè)酵母特有。如將等位基因橫軸從中分為兩部分，除二核苷酸重復(fù)C11位點(diǎn)外，野生酵母的等位基因傾向于出現(xiàn)在較大片段區(qū)；YOR267C和YPL009C位點(diǎn)商業(yè)酵母的特有等位基因傾向于分布在較小片段區(qū)域，ScAAT1位點(diǎn)較小片段區(qū)和較大片段區(qū)商業(yè)酵母特有基因數(shù)相等。等位基因頻率范圍從0.028～0.393。每個(gè)位點(diǎn)均出現(xiàn)有在商業(yè)酵母和野生酵母中表現(xiàn)差異較大的等位基因。每個(gè)位點(diǎn)每個(gè)群體中的等位基因分布不呈現(xiàn)明顯的規(guī)律，商業(yè)酵母YOR267C位點(diǎn)286 bp表現(xiàn)出較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，其他位點(diǎn)沒(méi)有主導(dǎo)的等位基因。

商 業(yè)酵母群體與野生酵母群體的遺傳距離無(wú)偏估計(jì)為0.828 3，遺傳一致性無(wú)偏估計(jì)[26]較低，為0.436 8，表明商業(yè)酵母與野生酵母兩者之間的遺傳差異明顯。4個(gè)位點(diǎn)的Fst值分別為0.025 8、0.047 3、0.066 3、0.091 2，較小，說(shuō)明群體內(nèi)部多樣性較高。

2.2 菌株的聚類分析

圖2 46株釀酒酵母菌的UPMGA聚類圖Fig.2 UPMGA dendrograms showinggenetic relationships among 46 yeast strains

運(yùn)用NTsys進(jìn)行采用UPMGA的遺傳多樣性分析，可將菌株劃分為3個(gè)群體如圖2所示。第一類12株野生酵母和1株來(lái)源于波爾多地區(qū)的商業(yè)酵母QA23，其中，173y1、174y15、173y73株菌具有相同的Interdelta基因型，微衛(wèi)星基因型不同而得以區(qū)分，三者的親緣關(guān)系較近。第二類包括13株商業(yè)酵母和4株野生酵母，多數(shù)商業(yè)酵母和野生酵母與其同類聚在一起，有趣的是，181y4與來(lái)源于法國(guó)的D47關(guān)系較近，23w12、173y10與來(lái)源于奧地利的R-HST關(guān)系較近，23w12、173y10具有相同的Interdelta基因型B，且有3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型相同。第三類包括4株商業(yè)酵母和12株野生酵母，兩者有清晰的界線，分為2支，12株野生酵母中有5株Interdelta基因型相同為M[27]，4株Interdelta基因型相同為J，說(shuō)明Interdelta基因型相同的菌株的微衛(wèi)星聚類親緣關(guān)系也較近。

3 討 論

一些菌株在一個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)2個(gè)條帶，可以認(rèn)定這些菌株在這個(gè)位點(diǎn)是二倍體且是雜合的。當(dāng)一個(gè)菌株在所有位點(diǎn)都表現(xiàn)出一條帶時(shí)，那么這個(gè)菌株的倍性不能被確定。26株野生酵母中有10株4個(gè)位點(diǎn)中至少有一個(gè)是雜合的。本實(shí)驗(yàn)所采用的微衛(wèi)星標(biāo)記與前人研究報(bào)道中的等位基因數(shù)的差別主要是由于研究群體的不同而引起的[20,28]。14w11、14w14、174y1、174y5這4株菌表現(xiàn)出相同的基因型；還有菌株112y14、181y1、182y5的基因型相同；菌株173y8和181y3的基因型相同；菌株23w15和173y15基因型相同。這些基因型相同的菌株，可能是同一株菌，也有可能是所選用的4個(gè)位點(diǎn)不足以將其區(qū)分開(kāi)，需要進(jìn)一步分析。然而這些菌株中有些菌株的Interdelta基因型不同，一些能被Interdelta PCR鑒別的菌株的微衛(wèi)星基因型卻不能被區(qū)分開(kāi)，這在前人的研究中也有報(bào)道[29]。

野生酵母的特有等位基因較少，原因可能為本實(shí)驗(yàn)中的酵母來(lái)源于同一產(chǎn)區(qū)同一葡萄品種的發(fā)酵過(guò)程，如果將野生酵母菌株擴(kuò)大到不同產(chǎn)區(qū)不同葡萄品種，應(yīng)該能得到更豐富的遺傳多態(tài)性。商業(yè)酵母來(lái)源較為廣泛，表現(xiàn)出遺傳多樣性較豐富。對(duì)特有等位基因的分析可以認(rèn)為，商業(yè)酵母特有等位基因傾向于較小的片段，野生酵母的特有等位基因傾向于較大的片段。

本研究表明ScAAT1、YOR267C、C11、YPL009C 4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性高，可作為釀酒酵母遺傳多樣性的有效遺傳標(biāo)記。46株釀酒酵母菌共檢測(cè)出66個(gè)等位基因，39種基因型，商業(yè)酵母和本土酵母遺傳多樣性豐富，并具有明顯差異。本研究為釀酒酵母的多樣性研究及優(yōu)良菌株選育奠定了基礎(chǔ)。

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Genetic Diversity Analysis of Saccharomyces cerevisiae Strains by Microsatellite Marker Technique

ZHANG Liu-yan1, HUANG Ying-zi1, LIU Yan-lin1,2,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-viniculture, Yangling 712100, China)

In order to analy ze the genetic diversity of indigenous wine yeasts and the differences between indigenous isolates and commercial wine yeast strains, genetic variability of 28 isolates from Jingyang, Shaanxi Province and 18 commercial strains was analyzed using four microsatellite markers (ScAAT1, YOR267C, C11 and YPL009C). Meanwhile, genetic parameter s were also analyzed by PopGen32. Forty-six strains were amplified by four microsatellite prime pairs, and generated a total of 66 polymorphic bands with 16–18 alleles for each locus. The average polymorphism information content (PIC) of all strains at four loci was 0.862 3, suggesting that all the four SSR loci were hypervariable. Forty-six strains gave 39 different patterns with a discriminatory power of 98.94%. The heterozygosity was observed as 0.478 3–0.658 5. These results indicate that indigenous wine yeasts and commercial yeasts have high levels of genetic diversity, and both have unique alleles. Both kinds of strains have clear clustering boundary in the phylogentic tree.

microsatellite; commercial yeasts; indigenous wine yeast; genetic diversity

Q93.331

A

1002-6630(2014)01-0130-04

10.7506/spkx1002-6630-201401025

2013-01-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31271917）；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（22050205）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（葡萄）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-30-jg-3）

張留燕（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)獒劸莆⑸铩-mail：forever7365@163.com

*通信作者：劉延琳（1966—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槠咸选⑵咸丫萍搬劸莆⑸?。E-mail：yanlinliu@nwsuaf.edu.cn