王 華，賀金梅,2

（1.中國農業(yè)科學院柑桔研究所，重慶 400712；2.西南大學食品科學學院，重慶 400715）

黑曲霉孢子粉真空冷凍干燥保護劑配方優(yōu)化

王 華1，賀金梅1,2

（1.中國農業(yè)科學院柑桔研究所，重慶 400712；2.西南大學食品科學學院，重慶 400715）

采用單因素試驗和混合均勻試驗設計，對黑曲霉孢子粉真空冷凍干燥保護劑配方進行篩選和優(yōu)化。通過Design-Expert軟件對實驗數據進行回歸分析，得到保護劑最佳配方為脫脂奶粉6.43 g/100 mL、蔗糖13.03 g/100 mL、甘油6.88 g/100 mL，孢子存活率預測值為88.82%，實際值為87.03%。

黑曲霉；保護劑；均勻試驗設計；存活率

與液態(tài)微生物菌劑相比，固態(tài)微生物活菌劑，具有保藏期長、不易污染，在運輸、貯藏、質量控制等方面有其獨特的優(yōu)勢[1-2]，還可直接作為發(fā)酵劑、添加劑研制開發(fā)其他雙歧保健食品和醫(yī)藥制劑等優(yōu)點，因而受到 愈來愈多的關注[3]。

目前關于菌種保藏的方法有真空冷凍干燥、噴霧干燥、流化床干燥、噴霧冷凍干燥等，在眾多的保藏方法中，因真空冷凍干燥法是在低溫、真空條件下進行的，有利于提高菌種的成活率和保存時間。但真空冷凍干燥過程中，冷凍和干燥兩個過程會造成部分微生物細胞的死亡、損傷及某些酶蛋白分子的鈍化[4]，具體表現(xiàn)在以下幾個方面：冷凍過程中水結冰時體積增大以及冰晶的機械作用，易破壞細胞內蛋白質活性部位一些較弱的化學鍵；水結冰后溶質濃度增加、pH值變化、離子強度增加、相分離；干燥過程中除去了與蛋白質、磷脂等生物大分子結合的大部分水分子，易導致蛋白質分子變性失活，細胞膜結構和功能改變。因此，為減少冷凍和干燥過程中對細胞活性的影響，通常加入不同類型的保護劑。保護劑可以改變微生物干燥時的物理、化學環(huán)境，減輕或防止干燥或復水對細胞的損害，盡可能保持微生物原有的各種生理生化特性和生物活性[5-6]，進而達到保護的目的，表1列出了常用的保護劑類型以及保護機理[7-18]。本實驗以黑曲霉為發(fā)酵菌種，采用均勻試驗設計，對黑曲霉冷凍干燥保護劑進行優(yōu)化。

表1 保護劑類型及其保護機理Table 1 Cryoprotectant types and corresponding protection mechanismsnisms

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

黑曲霉（Aspergillus niger）2281 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

菌種活化培養(yǎng)基：5°Bé麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：5°Bé麥芽汁1 000 mL、瓊脂15 g，自然pH值；菌落計數培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯300 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L、氯霉素0.1 g/L。

1.2 材料、試劑與儀器

脫脂奶粉 市售。

蔗糖（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；聚乙二醇（分析純） 天津天泰精細化學品有限公司；L-谷氨酸鈉（生化試劑）、甘油、乳糖、β-環(huán)狀糊精、硫酸錳、甘氨酸（均為分析純） 成都市科氏化工試劑廠。

ZHWY-200B恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；H1850R高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；VFD-2000冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 菌種培養(yǎng)和孢子收集

菌種經過活化、擴大培養(yǎng)后，用無菌水洗下孢子，制備孢子懸液。

1.3.3 活孢子計數

稀釋平板菌落計數法[19]，28～30℃培養(yǎng)48 h。

1.3.4 凍干后樣品的處里及孢子存活率計算

向凍干后樣品中加入10 mL無菌的生理鹽水，于37℃培養(yǎng)箱中放置15 min[20-21]；然后采用稀釋平板菌落計數法測定樣品中的活孢子數。

1.3.5 真空冷凍干燥工藝

黑曲霉活化后，直接用無菌水洗下孢子，顯微鏡計數并調整其濃度為1×109CFU/mL的孢子懸液，活孢子數用稀釋平板菌落計數法測定。于無菌的培養(yǎng)皿中加入2 mL孢子懸液，然后按保護劑與懸液體積比為2∶1的比例加入保護劑，保護劑與懸液平衡時間30 min；冷凍干燥各參數為：預凍溫度－40℃、預凍時間2 h、升華溫度－30℃、解析溫度25℃、干燥時間24h、真空度3～10Pa。

1.3.6 保護劑篩選

采用蔗糖、脫脂奶粉、乳糖、聚乙二醇、L-谷氨酸鈉、甘油、β-環(huán)狀糊精、硫酸錳、甘氨酸9種保護劑，將上述保護劑用蒸餾水分別配成不同質量濃度的溶液，121℃滅菌20 min后于4℃冰箱中備用。以蒸餾水作對照，測定凍干前后活孢子數，計算孢子存活率，每組試驗進行3次重復。

1.3.7 均勻設計試驗

根據單因素試驗結果，以孢子凍干存活率為試驗指標，對黑曲霉冷凍干燥保護劑效果較好的3種保護劑蔗糖、甘油、脫脂奶粉進行混合均勻試驗設計[22]，以確定真空冷凍干燥黑曲霉 孢子粉保護劑最佳配方，每組試驗進行3次重復。

2 結果與分析

2.1 單一保護劑實驗

圖1 保護劑對黑曲霉孢子凍干存活率的影響Fig.1 Effect of cryoprotectant type on survival rate of Aspergillus niger spores

由圖1可知，沒有添加任何保護劑的孢子凍干存活率只有10.07%，孢子凍干存活率隨著各種保護劑添加量的增加而增加；當乳糖、蔗糖、β-環(huán)狀糊精、脫脂奶粉、L-谷氨酸鈉、甘氨酸、聚乙二醇、甘油、硫酸錳的質量濃度分別為10、10、15、10、5、7、1、4、0.5 g/100 mL時，孢子凍干存活率最大，分別為27.81%、38.42%、22.49%、43.91%、28.51%、16.73%、25.05%、29.38%、12.75%。由于高質量濃度的保護劑會加速細胞內的蛋白質聚合，形成較強玻璃化結構，反而不利于細胞的保存，且復水效果不好[23]，所以，當保護劑的質量濃度超過它們的最佳濃度后，孢子凍干存活率隨著各種保護劑添加量的增加反而下降。

其中蔗糖、脫脂奶粉、甘油對黑曲霉孢子凍干保護效果較好。蔗糖、甘油屬于滲透型保護劑，脫脂奶粉屬于非滲透型保護劑[24]。蔗糖、甘油能透過細胞壁，進入細胞內，使細胞內溶質濃度升高，細胞內壓力接近于細胞外壓力，降低細胞外干燥或凍結引起的細胞脫水皺縮的程度和速度，從而減少對細胞的損傷。脫脂奶粉主要是保護細胞的表面免受傷害，在凍干時使溶液呈過冷狀態(tài)，降低溶液結冰的速度，避免細胞在冷凍或加熱時由于鹽類濃縮，使細胞脫水而導致細胞發(fā)生細胞壁和細胞膜的塌陷、滲透壓性休克、蛋白質變性等不良后果[25]。另外，蔗糖、甘油又是親水性保護劑，它們的羥基基團可與蛋白質形成氫鍵，從而代替蛋白質極性基團周圍的水分子，使蛋白質表面形成一層水化膜保護氫鍵，進而穩(wěn)定蛋白質的高級結構，防止蛋白質因干燥而變性[26]。

單因素試驗研究表明，其他幾種保護劑對黑曲霉孢子的保護效果都比較差，然而，即便是最佳質量濃度的脫脂奶粉，孢子最大凍干存活率也只有43.91%，難以達到工業(yè)化生產凍干孢子粉的目的。通常情況下，幾種保護劑復合使用，保護效果要比單一保護劑的效果好。根據單因素試驗結果，選用蔗糖、脫脂奶粉、甘油3種保護劑進行混合均勻試驗設計，以凍干存活率為試驗指標，以確定真空冷凍干燥黑曲霉孢子粉保護劑最佳配方。

2.2 均勻設計試驗

通過對脫脂奶粉、蔗糖、甘油3種保護劑對黑曲霉孢子凍干存活率的影響進行均勻試驗設計，結果如表2所示。利用Design-Expert軟件對表2中的試驗數據進行回歸分析，得到二次回歸方程：Y=2.373 40+ 6.846 02X1+18.745 47X3+0.788 991X1X2－1.421 04X1X3－0.737 71X2X3－0.571

表2 黑曲霉孢子凍干保護劑均勻試驗設計方案及結果Table 2 Uniform design and results for cryoprotectant optimization for for Aspergillus niger iger spores ores

由表3可得回歸方程顯著性檢驗F= 122.71＞F0.01（6,5）= 10.67，即回歸方程顯著。由表4中標準回歸系數的絕對值，可得各因素對黑曲霉凍干存活率影響的主次順序為X3＞X1＞X1X3＞X1X2＞X2X3＞。

對回歸方程求偏導，得最優(yōu)條件為X1=6.43、X2=13.02、X3=6.88，即當脫脂奶粉、蔗糖、甘油的質量濃度分別為6.43、13.03、6.88 g/100 mL時，黑曲霉孢子凍干存活率最大，達到88.82%。按照保護劑的最佳配方，3次重復實驗黑曲霉孢子凍干存活率平均值為87.03%，即凍干粉的活孢子數為4.3×109CFU/g，與預測值接近，無顯著差異，說明所建立回歸模型合理。而丁春杰等[27]對黑曲霉菌絲體真空冷凍干燥進行研究，發(fā)現(xiàn)當采用10 g/100 mL海藻糖和10 g/100 mL脫脂乳的復合保護劑時，能最大限度地提高菌絲體成活率，凍干菌粉中菌絲體含量也達到109CFU/g。海藻糖在高溫、高寒、高滲透、高壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下在細胞表面能形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質分子不變性失活，進而提高細胞存活率，保護效果好。但海藻糖成本較高，而本實驗采用較低成本的脫脂奶粉、蔗糖、甘油作為復合保護劑，凍干菌粉中孢子含量也達到4.3×109CFU/g。

由于儀器、操作人員不同、環(huán)境因素等影響，本實驗結果存在誤差，對于工業(yè)化大規(guī)模生產黑曲霉孢子粉，還需根據凍干設備性能、產量、能源、成本等諸多因素確定最佳的凍干保護劑配方。

表3 黑曲霉孢子凍干保護劑回歸方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model forcryoprotectant optimization for Aspergillus niger spores

表4 黑曲霉孢子凍干保護劑優(yōu)化回歸系數顯著性檢驗Table 4 Signififi cance test of the regression coeffifi cients for cryoprotectant optimization for Aspergillus niger spores

3 結 論

本研究采用單因素試驗和混合均勻設計試驗，對黑曲霉孢子粉真空冷凍干燥保護劑配方進行了篩選和優(yōu)化。單因素試驗結果表明，蔗糖、脫脂奶粉、甘油的保護效果較好；通過回歸分析得到黑曲霉孢子粉真空冷凍干燥保護劑的二次回歸方程：Y=2.373 40+6.846 02X1+ 18.745 47X3+0.788 991X1X2－1.421 04X1X3－0.737 71X2X3－0.571 88。保護劑最佳配方為脫脂奶粉6.43 g/100 mL、蔗糖13.03 g/100 mL、甘油6.88 g/100 mL，3次驗證實驗黑曲霉孢子凍干存活率平均值為87.03%。

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Optimization of Cryoprotectant Formulation for Vacuum Lyophilization of Spore Power of Aspergillus niger

WANG Hua1, HE Jin-mei1,2
(1. Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712, China; 2. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

A cryoprotectant composed of skim milk powder, sucrose and glycerol for vacuum lyophilized spore power of Aspergillus niger was developed and its formulation was optimized by one-factor-at-a-time and uniform design. By regression analysis of the experimental data, the optimal cryoprotectant formulation (per 100 mL of cryoprotectant) found to consisted of 6.43 g of skim milk powder, 13.03 g of sucrose, and 6.88 g of glycerol. The predicted survival rate of spore with the addition of the optimized cryoprotectant after freeze-drying was 88.82%, which was close to the actual value of 87.03%.

Aspergillus niger; cryoprotectant; uniform design; survival rate

Q93.336

A

1002-6630(2014)01-0159-04

10.7506/spkx1002-6 630-201401031

2013-06-25

國家現(xiàn)代農業(yè)（柑橘）產業(yè)技術體系建設專項（CARS-27-05C）

王華（1963—），男，研究員，本科，研究方向為柑橘深加工及貯藏。E-mail：wanghua40@126.com