蔣厚陽(yáng)，陳芝蘭，趙國(guó)華,3，楊吉霞,3,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院生物技術(shù)中心，西藏 林芝 860000；3. 重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技 術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

PCR-DGGE法分析西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的多樣性

蔣厚陽(yáng)1，陳芝蘭2，趙國(guó)華1,3，楊吉霞1,3,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院生物技術(shù)中心，西藏 林芝 860000；3. 重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技 術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

目的：運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction- denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)分析西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的生物多樣性。方法：從西藏8個(gè)牧區(qū)采集19份樣品，提取樣品總DNA，用巢式和降落PCR擴(kuò)增16S rRNA的V3區(qū)段，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物做變性梯度凝膠電泳，用NTsys 2.10e軟件分析條帶的相似性，切膠回收條帶并測(cè)序，鑒定菌種并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、分析優(yōu)勢(shì)菌種。結(jié)果：19份樣品中的乳酸菌菌群組成包括Lactobacillus paracasei、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus buchneri、Lactococcus raffinolactis、Leuconostoc mesenteroide、Lactobacillus plantarum、Pediococcus pentosaceus、Lactococcus lactis、Streptococcus thermophilus。綜合樣品和牧區(qū)的乳酸菌分布情況，確定Lactobacillus delbrueckii為優(yōu)勢(shì)菌種。結(jié)論：PCR-DGGE技術(shù)能夠有效分析西藏地區(qū)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的多樣性。

乳酸菌；生物多樣性；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和變性梯度凝膠電泳；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；優(yōu)勢(shì)菌種

西藏自治區(qū)是全國(guó)五大牧區(qū)之一，主要畜種是牦牛，共有400多萬(wàn)頭，占全國(guó)牦?？倲?shù)的30%[1-2]。牦牛奶是高原居民珍貴的食物，幾千年來(lái)牧民通過(guò)手工方式將牦牛奶發(fā)酵，制成奶酪、酸奶等各種乳制品[3]，來(lái)源于原料奶和環(huán)境的乳酸菌是發(fā)酵的主要菌種，對(duì)于乳制品風(fēng)味和質(zhì)地的形成起著至關(guān)重要的作用[4]。由于西藏不同區(qū)域的地理環(huán)境和氣候不同、牦牛奶成分和制作方法不同，以致不同作坊生產(chǎn)的乳制品中的乳酸菌存在差異。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然選擇，這些傳統(tǒng)乳制品中保留許多具有優(yōu)良特性的乳酸菌，為乳酸菌的研究開(kāi)發(fā)提供了寶貴的資源。

分析發(fā)酵食品中微生物的多樣性主要采用培養(yǎng)或者免培養(yǎng)技術(shù)。培養(yǎng)技術(shù)即用培養(yǎng)基增殖食品中的細(xì)菌，然后分離純化菌株，通過(guò)經(jīng)典的表型鑒定方法或者16S rRNA序列分析法對(duì)菌株進(jìn)行分類鑒定，該過(guò)程繁瑣、工作量大、不能鑒定出食品中不可培養(yǎng)的微生物，表型鑒定方法對(duì)于生理生化特性相似的菌株難以準(zhǔn)確區(qū)分和鑒定。近年來(lái)，已有少數(shù)學(xué)者將免培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于微生物多樣性分析中，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE），直接提取食品中的總DNA，用PCR擴(kuò)增16S rRNA的區(qū)段，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物做變性梯度凝膠電泳，能將大小相同堿基序列不同的條帶加以區(qū)分，理論上講，單個(gè)堿基差異的DNA片斷都能被區(qū)分為不同的條帶[5-6]，再結(jié)合序列分析技術(shù)，即可鑒定出菌種。PCR-DGGE技術(shù)已被用于發(fā)酵食品微生物多樣性分析中[7-8]，說(shuō)明它可以鑒定出食品中的微生物，分析出優(yōu)勢(shì)菌種，最大程度地反映樣品中微生物菌群存在的原始狀態(tài)，在微生物多樣性分析方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

本研究采用PCR-DGGE技術(shù)解析西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的菌群結(jié)構(gòu)、分析優(yōu)勢(shì)菌群，探討生物多樣性，以獲得乳酸菌的基本信息，為乳制品中乳酸菌的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

自西藏各地區(qū)共采集19份發(fā)酵乳制品樣品，基本信息如表1所示。

表1 供試樣品的基本信息Table 1 Information on the samples tested in this study

1.1.2 試劑

100 bp DNA ladder、Taq酶（5 U/μL）、dNTPs（10mmol/L）、10×酶緩沖液、MgCl2（25mmol/L）、PrimeSTAR MAX DNA Polymerase 寶生物工程（大連）有限公司；EDTA-Na2、Tris-base、DEPC水 加拿大BBI公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；蛋白酶K、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺（N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine，TEMED） 美國(guó)Sigma公司；Gelred核酸染料 美國(guó)Biotium公司；引物、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、PCR產(chǎn)物純化試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；去離子甲酰胺 美國(guó)Amresco公司；深加工食品提取試劑盒（DP326） 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S1000高性能PCR儀、164-5050伯樂(lè)基礎(chǔ)電源電泳儀、通用突變檢測(cè)系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；Syngene GeneGenius凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Syngene有限公司；Biospec-mini型DNA/RNA/蛋白質(zhì)分析裝置 日本島津制作所；HB031金屬恒溫加熱器 上海博彩生物技術(shù)有限公司；SIM-F140AY65型制冰機(jī) 日本Sanyo電器集團(tuán)；1-15PK小型臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA的提取

用試劑盒（DP326）提取樣品中細(xì)菌總DNA，提取后的DNA溶液，適當(dāng)稀釋后測(cè)其OD260nm、OD280nm及其比值，保存于－20℃，利用下式計(jì)算DNA質(zhì)量濃度（ρ）[9]，為后續(xù)的擴(kuò)增步驟提供參考依據(jù)。

1.3.2 巢氏PCR擴(kuò)增

利用巢氏PCR進(jìn)行兩步擴(kuò)增，以第一步擴(kuò)增的產(chǎn)物為模版進(jìn)行第二次擴(kuò)增[10]，使目的PCR產(chǎn)物濃度增大。先采用引物8f（5’-GGA GAG TTT GAT CA/CT GGC Y-3’）和798r[11]（5’-CCA GGG TAT CTA ATC CTG TT-3’）對(duì)樣品DNA進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s、56℃退火40 s、72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10 min。25 μL反應(yīng)體系為：模板DNA 50 ng，10×Taq酶緩沖液（無(wú)Mg2+）2.5 μL，2.5 mmol/L MgCl22.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 μmol/L引物2 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，滅菌純水補(bǔ)至25 μL。

引物8f和798r擴(kuò)增后產(chǎn)物用試劑盒純化，再用降落PCR擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)段，引物為338f（帶GC夾子（下劃線處）5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’）和518 r[12]（5’-ATT ACC GCG GCT GG-3’），PCR反應(yīng)程序[12]為：94℃預(yù)變性3 min，98℃變性10 s、65～55℃退火5 s（每次循環(huán)降0.5℃）、72℃延伸30 s，20個(gè)循環(huán)；98℃變性10 s，55℃退火5 s，72℃延伸30 s，然后72℃延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳，Gelred染色后用紫外成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.3.3 DGGE分析

DGGE膠的制備：10%聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺質(zhì)量比37.5∶1），變性梯度為30%～50%[12]（100%變性劑含有7 mol/L尿素和40%甲酰胺）。

將DGGE膠板放入裝有0.5×TAE的電泳槽中，加樣量10 μL，在60℃恒溫條件下，先200 V預(yù)電泳10 min，然后在90 V固定電壓下電泳10 h[13-14]。

1.3.4 EB染色及切膠回收測(cè)序

將DGGE膠放入1×TAE液中（含0.5 mg/L EB）浸泡10 min，棄掉浸泡液，再次將DGGE膠放入1×TAE液中浸泡10 min，紫外成像系統(tǒng)觀察并拍照。切下膠上各個(gè)位置的條帶，放入滅菌1.5 mL離心管中（含有20 μL滅菌DEPC水），4℃放置24 h[15]。

以切膠回收DNA為模板，用引物338f（5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG -3’）和518r（5’-ATT ACC GCG GCT GG-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s、56℃退火40 s、72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10min。25μL擴(kuò)增反應(yīng)體系：2μL DNA模板，10×Taq酶緩沖液（無(wú)Mg2+）2.5μL，2.5mmol/L MgCl22.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 μmol/L引物2 μL，5 U/μL Taq 酶0.2 μL，滅菌純水補(bǔ)至25 μL。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序（338f和518r雙向測(cè)序）。

1.3.5 結(jié)果分析

測(cè)序結(jié)果采用Bioedit 7.01和Contig Express軟件進(jìn)行比對(duì)拼接，拼接結(jié)果登陸NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast/）上進(jìn)行查詢，利用Clustal1.83和MEGA5.0制作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品巢氏PCR結(jié)果

圖1 引物8f+798r對(duì)16S rRNA可變區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Amplicon profiles of 16S rRNA variable region by PCR with primer 8f+798r

通過(guò)巢氏PCR對(duì)樣品16S rRNA的V3可變區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖1顯示了用引物8 f+798 r對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增后的瓊脂糖電泳圖，利用引物8 f+798 r在750 bp位置的稍上方都擴(kuò)增出了特異性條帶，圖2顯示了用引物338 f（GC夾子）+518 r對(duì)引物8 f+798 r擴(kuò)增后的DNA進(jìn)行擴(kuò)增后的瓊脂糖電泳圖，所有樣品在200 bp附近都有引物338 f（GC夾子）+518 r擴(kuò)增出的特異性條帶。進(jìn)一步對(duì)特異性條帶進(jìn)行DGGE電泳。

圖2 引物33388ff（GGCC夾子）+518r PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Amplicon profiles of 16S rRNAV3 variable region of bacteria total DNA from Tibetan fermented dairy product samples by nested PCR

2.2 PCR-DGGE結(jié)果分析

圖3 西藏發(fā)酵乳制品中細(xì)菌16S rRNA V3可變區(qū)的DGGE電泳圖Fig.3 DGGE fingerprinting of 16S rRNA V3 variable region of bacterial total DNA for Tibetan fermented dairy samples

由圖3可知，19個(gè)不同的發(fā)酵乳制品中細(xì)菌16S rRNA V3片段經(jīng)DGGE電泳后，呈現(xiàn)出不同的條帶圖譜，共有16個(gè)條帶，其中a和b是1～10號(hào)樣品所共有的條帶，i為11～19號(hào)樣品所共有的條帶。用NTsys 2.10e做DGGE圖譜的聚類分析如圖4所示，19個(gè)樣品條帶的相似性系數(shù)范圍是0.125～1.00，樣品6和11、6和18相似性系數(shù)最低（0.125），樣品1和7、3和4、13和14、15、16的相似性系數(shù)為100%。結(jié)果表明：不同樣品的條帶之間不僅存在一定的共性，更多的是差異性，反映出乳酸菌菌群結(jié)構(gòu)的多樣性，圖譜的聚類與地域之間無(wú)明顯的相關(guān)性。

圖4 用NTsys 2.10e構(gòu)建的DGGE電泳圖譜聚類分析Fig.4 Clustering analysis profile of DGGE patterns of 19 samples constructed by NTsys 2.10e software

2.3 測(cè)序結(jié)果及其相似性分析

表2 西藏發(fā)酵乳制品DGGE指紋圖譜上條帶的序列分析結(jié)果Table 2 Sequence analysis results for DGGE bands of Tibetan fermented dairy samples

表2列出了所有DGGE切膠條帶通過(guò)序列分析后所鑒定出的菌株，這些菌株全部都是乳酸菌。圖5顯示了乳酸菌V3區(qū)序列的聚類結(jié)果，同表2所鑒定出的結(jié)果完全符合，進(jìn)化樹(shù)主要分為3個(gè)大的分支，第1分支包括f、n、b、m、c、j、o、k、l、i、p這些切膠條帶通過(guò)序列分析所鑒定出的菌株；第2分支包括a、e、g、h這些切膠條帶通過(guò)序列分析鑒定出的菌株；第3分支包括條帶d切膠序列分析鑒定出的菌株。

圖5 基于16S rRNA V3區(qū)序列的乳酸菌菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA V3 variable regions of lactic acid bacteria and relevant strains

表3 從19個(gè)樣品中鑒定出的乳酸菌菌種及優(yōu)勢(shì)菌種Table 3 S train identification and dominant species of latica acid bacteria in fermented dairy product samples

表4 各地區(qū)乳酸菌菌株的分布情況Table 4 The regional distribution of the lactic acid bacteria identified from fermented dairy product samples

2.4 各樣品中鑒定出的乳酸菌及優(yōu)勢(shì)菌種

如表3所示，從19個(gè)樣品中鑒定出12個(gè)乳酸菌菌種：Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus fermentum、Lactococcus raffinolactis、Lactococcus lactis、Leuconostoc mesenteroides、Strepotococcus thermophilus、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus plantarum、Pediococcus pentosaceus、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus crispatus。阿里、那曲、昌都、拉薩、林芝、山南、日喀則地區(qū)大部分樣品中數(shù)量占優(yōu)勢(shì)的菌種為L(zhǎng)actobacillus delbrueckii，也有小部分樣品為Pediococcus pentosaceus。由此可以看出，西藏的傳統(tǒng)乳制品中含有豐富的乳酸菌菌種，不同地區(qū)、甚至相同地區(qū)不同作坊的樣品，菌種有較大差異，反映出乳酸菌的生物多樣性。樣品的優(yōu)勢(shì)菌種呈現(xiàn)出一定的共性，這說(shuō)明Lactobacillus delbrueckii和Pediococcus pentosaceus可能在奶酪的后期發(fā)酵起到重要作用。

2.5 乳酸菌菌種按地區(qū)的分布情況

如表4所示，那曲和拉薩地區(qū)的樣品鑒定出11種乳酸菌，種類最為豐富，其次為當(dāng)雄和阿里地區(qū)的樣品，均鑒定出10種乳酸菌，昌都地區(qū)的樣品鑒定出8種乳酸菌，林芝、山南、日喀則地區(qū)的樣品鑒定出4種乳酸菌。鑒定出最多的菌種是Lactobacillus delbrueckii，其次為Streptococcus thermophiles和Lactococcus lactis，它們?cè)?個(gè)牧區(qū)是普遍存在的。綜合樣品和牧區(qū)的乳酸菌分布情況，Lactobacillus delbrueckii為優(yōu)勢(shì)菌種。

3 討 論

目前對(duì)西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的研究報(bào)道比較少，基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)不多。陳芝蘭等[16]從3份酸奶樣品和2份奶渣樣品中分離出15株乳酸桿菌和4株乳酸球菌，采用傳統(tǒng)分類和16S rDNA基因序列測(cè)定的方法鑒定出菌種，包括Lactobacillus paracasei、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus brevis、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus、Pediococcus acidilactici，其中L.paracasei為優(yōu)勢(shì)菌種（占總分離菌株的55.6%）。艾日登才次克[17]從日喀則、拉薩和那曲3個(gè)地區(qū)44份樣品中分離出171株乳酸菌（122株乳桿菌和49株乳球菌），采用傳統(tǒng)分類和16S rRNA序列分析法鑒定出12個(gè)菌種，其中Lactobacillus fermentum和Lactobacillus casei是最常見(jiàn)的菌種，分別占總分離株的29.9%和26.9%，其次為L(zhǎng)actococcus lactis subsp. lactis和Lactobacillus plantarum，其余菌種包括Lactobacillus helveticus、Lactobacillus curvatus、Enterococcus duarus、Enterococcus faecium、Lactococcus lactis subsp. cremoris、Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides、Leuconostoc pseudomesenteroides、Lactococcus garvieae。張彥斌[18]采用宏基因組方法，從當(dāng)雄地區(qū)3個(gè)樣品中鑒定出8種乳酸菌：Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus、Lactococcus lactis subsp. cremoris、Lactococcus lactis subsp. lactis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus helveticus、Streptococcus thermophilus、Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides、Lactobacillus kefiri。其中Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus和Lactobacillus helveticus為優(yōu)勢(shì)菌群。本研究采用PCR-DGGE法從西藏8個(gè)牧區(qū)共計(jì)19份樣品中鑒定出12個(gè)菌種：Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus fermentum、Lactococcus raffinolactis、Lactococcus lactis、Leuconostoc mesenteroides、Strepotococcus thermophilus、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus plantarum、Pediococcus pentosaceus、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus crispatus。與已有的報(bào)道相對(duì)比，可知Lactobacillus paracasei、Lactobacillus fermentum、 Lactobacillus delbrueckii、Leuconostoc mesenteroides為西藏傳統(tǒng)乳制品中比較常見(jiàn)的菌種，而Lactobacillus crispatus、Lactococcus raffinolactis未見(jiàn)報(bào)道[16]。

已有的研究報(bào)道大多采用培養(yǎng)法分析乳制品中乳酸菌的生物多樣性，“培養(yǎng)”過(guò)程往往引入一定的偏差。例如，不同屬種的乳酸菌培養(yǎng)條件不同，大部分乳桿菌于37℃用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，嗜熱鏈球菌于45℃用M17培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，乳球菌屬的最適生長(zhǎng)溫度為30℃，所以必須用多種培養(yǎng)基在不同的溫度下培養(yǎng)，將所有鑒定結(jié)果加以綜合，才能獲得比較全面的菌種信息。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，樣品中乳酸菌之間可能存在相互克制等作用，直接影響對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種的判斷。本研究采用PCR-DGGE技術(shù)，一次實(shí)驗(yàn)?zāi)芡瑫r(shí)測(cè)出乳桿菌、乳球菌和嗜熱鏈球菌，節(jié)省了大量工作，而且可以克服“培養(yǎng)”過(guò)程帶來(lái)的誤差，通過(guò)條帶的明暗粗細(xì)直接判斷出樣品中的優(yōu)勢(shì)菌種。

國(guó)外學(xué)者較早將PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用于乳制品中微生物的分析中。Hoorde等[19]研究高達(dá)式（Goudatype）奶酪中乳酸菌的多樣性，同時(shí)采用PCR-DGGE技術(shù)和傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法結(jié)合16S rDNA序列分析法鑒定菌種，PCR-DGGE方法鑒定出了培養(yǎng)方法未能檢出的菌種：Enterococcus faecalis、Lactobacillus parabuchneri、Lactobacillus gallinarum，同時(shí)，培養(yǎng)方法分離鑒定出的菌株，PCR-DGGE技術(shù)也沒(méi)有全部鑒定出來(lái)。Gala等[20]也同時(shí)用培養(yǎng)和免培養(yǎng)的技術(shù)分析成熟12個(gè)月的Parmigiano Reggiano奶酪中優(yōu)勢(shì)乳酸菌的多樣性，用PCR-DGGE法檢測(cè)出Lactobacillus fermentum在幾個(gè)樣品中是優(yōu)勢(shì)菌種，但是用培養(yǎng)方法未能檢出。兩位學(xué)者都推薦將培養(yǎng)和免培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，以便有效地描述奶酪中的乳酸菌。

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Investigating the Diversity of Lactic Acid Bacteria in Tibetan Traditional Fermented Dairy Products by PCR-DGGE

JIANG Hou-yang1, CHEN Zhi-lan2, ZHAO Guo-hua1,3, YANG Ji-xia1,3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Center of Biology, College of Agricultural and Animal Husbandry, Tibet University, Linzhi 860000, China; 3. Chongqing Key Laboratory of Agricultural Product Processing, Chongqing 400715, China)

Nineteen samples of Tibetan fermented dairy products were collected from eight pasturing areas and a polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) method was established to investigate the biodiversity of lactic acid bacteria in Tibetan fermented dairy products. After total DNA was extracted from dairy samples by a commercial kit (Tiangen DP326), the V3 region of the 16S rRNA gene was amplified by nested PCR and touchdown PCR, and the PCR-amplified products were subjected to DGGE electrophoresis. All bands were excised from the gel and sequenced, and the species of strains were identified and a phylogenetic tree was constructed. NTsys 2.10e software was used to analyze the similarity of band profiles. Results showed that the microbial flora of lactic acid bacteria in Tibetan fermented dairy products was composed of Lactobacillus paracasei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus buchneri, Lactococcus raffinolactis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis and Streptococcus thermophilus. Therefore the conclusion is drawn that Lactobacillus delbrueckii is the dominant species in most of the samples, and it simultaneously distributes in all eight pasturing areas. This study has successfully established a PCR-DGGE method to investigate the biodiversity of lactic acid bacteria in Tibetan fermented dairy products.

lactic acid bacteria; biodiversity; polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE); phylogenetic tree; dominant species

TS252.54

A

1002-6630(2014)01-0167-07

10.7506/spkx1002-6630-201401033

2013-01-11

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（XDJK2009C039）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31060020）

蔣厚陽(yáng)（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：rxxlcool@126.com

*通信作者：楊吉霞（1978—），女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：yangjx@188.com