尹學(xué)哲，趙文璽，金愛花，全吉淑,*

（1.延邊大學(xué)醫(yī)院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

大豆異黃酮對四氯化碳致小鼠肝臟氧化應(yīng)激和DNA損傷的干預(yù)作用

尹學(xué)哲1，趙文璽2，金愛花1，全吉淑2,*

（1.延邊大學(xué)醫(yī)院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

研究大豆異黃酮對四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘發(fā)的急性肝損傷小鼠肝臟氧化應(yīng)激和DNA損傷的干預(yù)作用。將50只小鼠隨機(jī)分為5組，即正常組、模型組、聯(lián)苯雙脂組及大豆異黃酮高、低劑量組。每日給藥1次，連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，除正常組外，其余組小鼠腹腔注射CCl4建立急性肝損傷模型。分光光度法檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶活性、白蛋白含量，肝臟超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶活性及還原型谷胱甘肽、丙二醛含量，蛋白印跡法檢測血紅素加氧酶-1蛋白表達(dá)，電泳法檢測小鼠肝細(xì)胞DNA損傷情況。結(jié)果表明：大豆異黃酮明顯降低CCl4致急性肝損傷小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶活性；降低肝組織丙二醛水平；升高肝組織總超氧化物歧化酶、Mn-超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶活性和還原型谷胱甘肽水平；升高肝線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性；上調(diào)肝組織血紅素加氧酶-1蛋白表達(dá)；并減少肝細(xì)胞DNA損傷程度。提示，大豆異黃酮對CCl4致急性肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其降低肝組織氧化應(yīng)激和DNA損傷作用有關(guān)。

大豆；異黃酮；四氯化碳；肝損傷；氧化應(yīng)激；DNA損傷

大豆異黃酮（soy isoflavones，ISOF）是一類從大豆中分離的生物活性成分，目前發(fā)現(xiàn)的大豆異黃酮共有12種，分為游離型的苷元和相應(yīng)的糖苷[1]。大豆異黃酮主要分布于大豆胚軸中，具有防治癌癥、降低血脂、防止動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、預(yù)防骨質(zhì)疏松和改善婦女更年期綜合征等多種生理功能[1-2]。近年來，大豆異黃酮在肝病防治中的應(yīng)用也越來越受關(guān)注。研究表明，大豆異黃酮對肝纖維化[3-6]及四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）等化學(xué)物質(zhì)所致的肝損傷[7-10]具有保護(hù)作用，但保護(hù)機(jī)制研究大多局限于其對肝臟和其他臟器的抗氧化作用，尚未見到其對肝線粒體氧化應(yīng)激和DNA損傷的干預(yù)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立CCl4致小鼠急性肝損傷模型，進(jìn)一步觀察大豆異黃酮對CCl4致急性肝損傷小鼠肝臟氧化應(yīng)激和DNA損傷的干預(yù)作用，探討ISOF的保肝作用機(jī)制，旨在為大豆資源開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

ISOF（純度80%） 西安中鑫生物技術(shù)有限公司；CCl4美國Sigma公司；聯(lián)苯雙脂（bifendate，BFD）浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠；兔血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）多克隆抗體 美國Abcam公司；白蛋白（albnmin，ALB）測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）測試盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）測試盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）測試盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測試盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測試盒、Mn-超氧化物歧化酶（Mn-superoxide dismutase，Mn-SOD）測試盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）測試盒、Na+-K+-ATP酶（Na+-K+-ATPase）測試盒、Ca2+-Mg2+-ATP酶（Ca2+-Mg2+-ATPase）測試盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒及蛋白測試盒 南京建成科技有限公司。

3-30 K型離心機(jī) 美國Sigma公司；S22PC型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DYY-12型電泳儀、DYCP-31D型電泳槽、DYCZ-24DN型電泳儀 北京六一儀器廠；Trans- Blot轉(zhuǎn)印槽 美國Bio-Rad公司；UVP凝膠成像分析儀 美國UVP公司。

1.2 動(dòng)物

昆明小鼠，雄性，體質(zhì)量為18～22 g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

將50只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，即正常組、模型組、BFD組、ISOF高、低劑量組。每日灌胃給藥1次，連續(xù)7d，BFD劑量為50mg/（kg·d），ISOF高劑量為240mg/（kg·d），低劑量為120 mg/（kg·d），正常組及模型組小鼠則灌 胃等體積生理鹽水。末次給藥1h后，除正常組腹腔注射等體積大豆油外，其余各組小鼠腹腔注射給予40mg/kg CCl4（注射體積分?jǐn)?shù)為0.5%的CCl4大豆油5mL/kg）。造模期間禁食，不禁水?；A(chǔ)飼料由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼料中的豆粕成分按食物成分表[11]替換成酪蛋白和淀粉。

1.3.2 血清生化指標(biāo)的檢測

造模16 h，分離血清，檢測小鼠血清ALB含量和ALT、AST、ALP活性，按試劑盒操作說明書進(jìn)行測定，并按公式計(jì)算藥物對酶活性的抑制率[12]。

式中：A正常、A模型和A治療分別為正常組、模型組和治療組的吸光度。

1.3.3 肝組織氧化應(yīng)激、抗氧化指標(biāo)以及DNA損傷的檢測

常規(guī)方法制備肝勻漿和肝線粒體。按照各測試盒操作方法測定T-SOD、CAT、GSH-Px、Mn-SOD、GSH、MDA、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase及蛋白水平。常規(guī)提取肝微粒體，蛋白印跡法檢測肝組織HO-1蛋白表達(dá)情況[13]。提取肝細(xì)胞DNA，上瓊脂糖凝膠電泳，檢測肝細(xì)胞DNA損傷情況[14]。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用±s表示，應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t-檢驗(yàn)和方差分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISOF對肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP活性和ALB含量的影響

表1 ISOF對肝臟損傷小鼠血清ALT、AST、ALP活性和ALB含量的影響Table 1 Effect of ISOF on serum ALT, AST, ALP and ALB

表1 ISOF對肝臟損傷小鼠血清ALT、AST、ALP活性和ALB含量的影響Table 1 Effect of ISOF on serum ALT, AST, ALP and ALB

注：*. 與正常組相比，有顯著性差異（P＜0.05）；#.與模型組相比，有顯著性差異（P＜0.05）。下同。

組別劑量/（mg/（kg·d））ALT活力/（U/L）AST活力/（U/L）ALP活力/（U/L）ALB含量/（g/dL）正常組30.2±6.968.7±4.2127±203.8±0.6模型組59.7±15.2* 110.4±10.7* 159±23* 2.9±0.9 ISOF組12032.6±5.4#88.5±9.6#146±213.3±0.8 24032.2±7.6#86.3±7.3#128±19#3.5±0.6 BFD組5031.4±9.1#80.5±5.8#127±17#3.4±0.7

由表1可見，與正常組比較，模型組小鼠血清ALT、AST和ALP活性明顯升高（P＜0.05），表明小鼠急性肝損傷模型制備成功；與模型組比較，ISOF高、低劑量組小鼠血清ALT和AST活性明顯降低（P＜0.05），ISOF高劑量組血清ALP活性明顯降低（P＜0.05），提示ISOF對CCl4所致肝損傷具有保護(hù)作用。ISOF高劑量組對血清ALT、AST和ALP活性的抑制率分別為93%、58%和97%，接近BFD組的96%、72%和99%，說明其保肝活性稍弱于BFD。與正常組比較，模型組小鼠血清ALB水平趨于降低，而ISOF和BFD干預(yù)有增高血清ALB的趨勢，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 ISOF對肝損傷小鼠肝組織MDA水平的影響

圖1 ISOF對肝臟損傷小鼠肝及其線粒體MDA水平的影響Fig.1 Effect of ISOF on MDA level in liver and liver mitochondria

如圖1所示，CCl4處理后模型組小鼠肝勻漿及肝線粒體MDA含量明顯增高（P＜0.05），說明CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷能引起肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷。ISOF治療可明顯降低肝勻漿及肝線粒體MDA水平（P＜0.05）。ISOF高劑量組小鼠肝勻漿及肝線粒體MDA水平分別降低79%和73%，接近或超過BFD組的72%和78%。

2.3 ISOF對肝損傷小鼠肝組織GSH水平的影響

圖2 ISOF對肝臟損傷小鼠肝及其線粒體GSH水平的影響Fig.2 Effect of ISOF on GSH level in liver and liver mitochondria

由圖2可知，CCl4處理使模型組小鼠肝勻漿及肝線粒體GSH含量明顯降低（P＜0.05），而ISOF治療可明顯升高肝勻漿GSH水平（P＜0.05），高劑量ISOF可明顯升高肝線粒體GSH水平（P＜0.05）。提示，ISOF有助于提高肝組織抗氧化能力。

2.4 ISOF對肝損傷小鼠肝組織抗氧化酶活性的影響

由表2可見，注射CCl4明顯降低模型組小鼠肝組織T-SOD、Mn-SOD、GSH-Px、CAT活性（P＜0.05），說明CCl4所致的急性肝損傷能引起肝組織抗氧化酶活性的降低。ISOF治療可明顯回升小鼠肝組織T-SOD、Mn-SOD和CAT活性（P＜0.05），高劑量ISOF明顯升高肝組織GSH-Px水平（P＜0.05），提高損傷肝細(xì)胞的抗氧化能力。

表2 ISOF對肝臟損傷小鼠肝組織T-SOD、Mn-SOD、GSH-Px和CAT活性的影Table 2 Effect of ISOF on T-SOD, Mn-SOD, GSH-Px and CAT activities in liver ti

表2 ISOF對肝臟損傷小鼠肝組織T-SOD、Mn-SOD、GSH-Px和CAT活性的影Table 2 Effect of ISOF on T-SOD, Mn-SOD, GSH-Px and CAT activities in liver ti

組別劑量/（mg/（kg·d））T-SOD活力/（U/mg）Mn-SOD活力/（U/mg）GSH-Px活力/（U/mg）CAT活力/（U/mg）正常組125.7±6.892.4±11.4326±3725.7±4.9模型組92.7±15.3* 64.7±8.9* 231±40* 19.9±4.5* ISOF組120125.9±12.9#81.5±10.2#285±3232.6±6.5#240132.2±15.4#86.2±12.1#307±36#27.7±5.2#BFD組50124.8±11.7#85.9±11.3#294±34#28.5±6.6#

2.5 ISOF對肝損傷小鼠肝線粒體ATPase活性的影響

圖3 ISOF對肝臟損傷小鼠肝線粒體NNaa+--KK+-ATPPaassee和CCaa22++--MMgg22++-ATPase活性的影響Fig.3 Effect of ISOF on Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities in liver mitocho ndria

如圖3所示，與正常組比較，模型組小鼠肝線粒體Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低（P＜ 0.05），說明CCl4引起急性肝損傷小鼠肝線粒體能量代謝障礙及功能損傷。ISOF治療可回升小鼠肝線粒體Na+-K+-ATPase活性（P＜0.05），高劑量ISOF升高肝線粒體Ca2+-Mg2+-ATPase活性（P＜0.05）。提示，ISOF有助于改善急性肝損傷小鼠肝線粒體功能障礙。

2.6 ISOF對肝損傷小鼠肝組織HO-1蛋白表達(dá)的影響

圖4 ISOF對肝臟損傷小鼠肝組織HO-1蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of ISOF on HO-1 protein expression in liver tissues

如圖4所示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織HO-1蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）；與模型組比較，高劑量ISOF組小鼠肝組織HO-1蛋白表達(dá)進(jìn)一步增高（P＜0.05），而BFD不影響小鼠肝臟HO-1蛋白表達(dá)水平。

2.7 ISOF對肝損傷小鼠肝組織DNA損傷的影響

圖5 ISOF對肝臟損傷小鼠肝組織DNA損傷的影響Fig.5 Effect of ISOF on DNA damage in liver tissues

DNA電泳結(jié)果（圖5）顯示，注射CCl4可明顯增高模型組小鼠肝細(xì)胞DNA損傷，DNA隨機(jī)降解呈模糊涂片狀，另有少量部分DNA斷裂形成梯形條帶，說明CCl4導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，并伴隨個(gè)別肝細(xì)胞凋亡。模型組小鼠肝細(xì)胞DNA損傷明顯高于正常組（P＜0.05），而高劑量ISOF可明顯降低急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞DNA損傷程度（P＜0.05）。

3 討 論

CCl4所致急性肝損傷模型是最早使用的經(jīng)典動(dòng)物模型。該模型能準(zhǔn)確反映肝細(xì)胞的功能、代謝及形態(tài)學(xué)變化，重復(fù)性較好，是篩選保肝活性物質(zhì)的常用模型之一[15-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ISOF可明顯降低CCl4所致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST和ALP活性，提示ISOF可減輕CCl4所致肝細(xì)胞損傷。

CCl4引發(fā)的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致肝損傷的重要途徑。CCl4在肝內(nèi)經(jīng)微粒體細(xì)胞色素P450分解活化，生成活潑的三氯甲基自由基和氯自由基，導(dǎo)致肝微粒體的脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，使肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受到損害[18]。因此，對氧化應(yīng)激導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的研究便成為治療肝臟疾病的一個(gè)重要途徑[19-20]。SOD、CAT和GSH-Px是抗氧化酶，而Mn-SOD是線粒體主要抗氧化酶，在細(xì)胞內(nèi)起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[21]。GSH是有效的巰基抗氧化劑，能有效防止脂質(zhì)過氧化，從而減弱氧化應(yīng)激[22-23]。本實(shí)驗(yàn)表明，模型組小鼠肝臟抗氧化酶活性降低，GSH水平降低，脂質(zhì)過氧化水平升高，而ISOF可增高肝損傷小鼠肝臟抗氧化酶活性和GSH水平，降低脂質(zhì)過氧化水平。提示ISOF可抑制氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，最終抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成。線粒體是細(xì)胞能量代謝中心，自由基與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損傷線粒體膜、使伴有ATP依賴性酶活性降低[15]。Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase是存在于線粒體膜上的重要ATP酶，是反映細(xì)胞能量代謝及功能損傷的重要指標(biāo)[24]。本實(shí)驗(yàn)表明，模型組小鼠肝線粒體Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低，表明急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞線粒體能量代謝障礙及鈣泵活性降低，存在一定程度的線粒體氧應(yīng)激和功能損傷。這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[15,24]，CCl4進(jìn)入機(jī)體后產(chǎn)生大量自由基，自由基與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損傷線粒體膜，導(dǎo)致線粒體水腫和ATP合成減少，并伴有ATP依賴性酶的活性降低，而后者又能加重線粒體的損傷。ISOF可增高肝損傷小鼠肝組織抗氧化能力，減輕自由基對線粒體的損傷和改善線粒體功能障礙，從而對線粒體起到保護(hù)作用。

HO-1是生物體內(nèi)具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗增殖等廣泛生物學(xué)活性的應(yīng)激蛋白。HO-1的抗氧化機(jī)制與其對促氧化底物血紅素的分解及多種活性代謝產(chǎn)物的生成密切相關(guān)，如膽紅素、CO及由于Fe2+的生成而明顯增加的鐵蛋白水平，均具有直接或間接的抗氧化效應(yīng)[25]。結(jié)果顯示，CCl4注射引起模型組小鼠肝組織HO-1表達(dá)增高，而ISOF預(yù)處理使小鼠肝組織HO-1表達(dá)進(jìn)一步增高，從而對急性肝損傷小鼠肝組織起到應(yīng)激保護(hù)作用。

CCl4可導(dǎo)致肝小葉細(xì)胞壞死，細(xì)胞核固縮，肝細(xì)胞DNA降解。DNA涂片狀是細(xì)胞壞死的典型生化特征，而DNA片段化是細(xì)胞凋亡的典型生化特征[21]。結(jié)果顯示，CCl4導(dǎo)致大部分肝細(xì)胞DNA無規(guī)律隨機(jī)降解，呈現(xiàn)細(xì)胞壞死特征，另有部分DNA斷裂形成梯形條帶，呈現(xiàn)凋亡特征。說明CCl4導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，并伴隨個(gè)別肝細(xì)胞凋亡。而ISOF預(yù)處理可明顯降低急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞DNA損傷程度。

綜上所述，ISOF對CCl4致急性肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其降低肝組織氧化應(yīng)激以及DNA損傷有關(guān)。該研究結(jié)果對ISOF在保肝方面的開發(fā)利用具有一定的參考價(jià)值。

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Intervention Effect of Soy Isoflavones on Hepatic Oxidative Stress and DNA Damage Induced by Carbon Tetrachloride in Mice

YIN Xue-zhe1, ZHAO Wen-xi2, JIN Ai-hua1, QUAN Ji-shu2,*
(1. Yanbian University Hospital, Yanji 133000, China; 2. Yanbian University Medical College, Yanji 133000, China)

The intervention effect of soy isoflavones (ISOF) on oxidative stress and DNA damage in a mouse model of acute liver injury induced by carbon tetrachloride (CCl4) was investigated. Fifty mice were randomly divided into 5 groups including normal control, model control, bifendate (BFD), high-dose ISOF and low-dose ISOF groups. Animals were treated once daily for 7 days. At the end of the experiments, CCl4was injected intraperitoneally to the mice from four groups except the normal control group. Then, alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP), albumin (ALB), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px), Na+-K+-ATPase, Ca2+-Mg2+-ATPase, reduced glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) were determined spectrometrically, and protein expression of heme oxygenase-1 (HO-1) was assayed through western blotting, and DNA damage was evaluated by electrophoresis. The results showed that the administration of ISOF reduced serum activities of ALT, AST and ALP GSH-Px; decrease MDA content in liver; in creased total SOD, Mn-SOD, GSH-Px and CAT activi ties and GSH level in li ver; enhanced Na+- K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities in liver mitochondria; up-regulated the expression of HO-1 protein; and reduced DNA damage of hepatocytes in mice with acute liver injury. Therefore, ISOF exerts a protective function on acute liver injury induced by CCl4in mice, probably via reducing oxidative stress and DNA damage in liver tissue.

soy; isoflavones; carbon tetrachloride (CCl4); liver injury; oxidative stress; DNA damage

R285.5

A

1002-6630(2014)01-0214-05

10.7506/spkx1002-6630-201401042

2013-01-21

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30360113；81160539）

尹學(xué)哲（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。E-mail：yinxz@ybu.edu.cn

*通信作者：全吉淑（1968—），女，教授，碩士，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。E-mail：quanjs@ybu.edu.cn