郭卓雨，高麗萍，李 貞

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

葡萄籽原花青素對順鉑誘導(dǎo)人胚腎細(xì)胞凋亡的拮抗作用

郭卓雨，高麗萍*，李 貞

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

目的：探討葡萄籽原花青素（g r a p e s e e d p r o a n t h o cy a n i d i n，G S P E）對順鉑（c i sdiamminedichloroplatinum，CDDP）誘導(dǎo)人胚腎細(xì)胞HEK293凋亡及相關(guān)凋亡基因的影響，并探討可能的機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)正常HEK293細(xì)胞，噻 唑藍(lán)法測定GSPE、CDD P分別對HEK293細(xì)胞生長的影響以及GSPE對CDDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞毒性的保護(hù)作用，流式細(xì)胞儀測定GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞凋亡率的變化，Western blotting測定GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞毒性具有拮抗作用，可減輕CDDP所致HEK293細(xì)胞凋亡，減弱Bax表達(dá)、增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)。結(jié)論：GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞凋亡具有拮抗作用，其機(jī)制可能與GSPE降低促凋亡基因Bax，升高抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

葡萄籽原花青素；順鉑；人胚腎細(xì)胞HEK293；細(xì)胞凋亡

順鉑（cis-diamminedichloroplatinum，CDDP）是抵御各種腫瘤的重要化療藥物之一，但因高劑量使用對腎臟產(chǎn)生較大毒性使其臨床使用受到限制。臨床應(yīng)用CDDP治療腫瘤的患者常出現(xiàn)急性腎功能衰竭癥狀[1]，主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞生化和細(xì)胞功能紊亂，其中包括抑制蛋白合成、氧化應(yīng)激、線粒體失功、細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞間黏附的變化及小管上皮細(xì)胞凋亡等。目前，CDDP所致腎毒性其細(xì)胞和分子機(jī)制尚未完全清楚[2]。文獻(xiàn)[3]記載，CDDP誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞凋亡在腎毒性中發(fā)揮重要作用。

葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyan idin，GSPE）是具有生物類黃酮活性的一大類多酚化合物，是國際公認(rèn)的最能有效清除體內(nèi)自由基的天然多酚類物質(zhì)[4]，由不同數(shù)量的黃烷-3-醇單元（即由（表）兒茶素、表?xiàng)攦翰杷鼗虮韮翰杷貨]食子酸酯）縮合而成。研究表明，GSPE可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[5-10]、促進(jìn)正常細(xì)胞生長[11]、改善抗氧化指標(biāo)[12]等。前期研究顯示GSPE可顯著抑制CDDP誘導(dǎo)人胚腎細(xì)胞氧化損傷作用，而對HEK293細(xì)胞凋亡的研究尚未見報道，因此本研究運(yùn)用CDDP造模，通過測定GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2表達(dá)量的影響，探究GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

HEK293細(xì)胞 由北京師范大學(xué)提供。

CDDP（注射用粉劑，批號H37021358，生理鹽水配制，過濾除菌避光保存，用時用MEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度） 齊魯制藥廠；葡萄籽原花青素提取物（純度大于95%，HPLC級，其中二聚體56%、三聚體12%、四聚體6.6%、單體和其他大分子質(zhì)量寡聚體20.4%。蒸餾水溶解，過濾除菌避光保存，用時用MEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度） 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；新生牛血清、MEM培養(yǎng)基 美國Gibco公司；胰蛋白酶、噻唑藍(lán) 美國Sigma公司；兔抗β-actin、Bcl-2、Bax多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗 Santa Cruz-中杉金橋生物技術(shù)公司；BCA蛋白測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 北京寶賽生物制品研究所；其他試劑均為分析純。

酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司；FACS Calibar流式細(xì)胞儀 美國BD公司；電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)基為含雙抗（100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）及含10%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基，于37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至70%～80%時傳代，隔1d換1次培養(yǎng)基，每2～3 d傳代1次并接種于新培養(yǎng)瓶。實(shí)驗(yàn)取指數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行。

1.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用噻唑藍(lán)比色法測定CDDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞的毒性作用、GSPE對正常HEK293細(xì)胞生長的影響以及GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞毒性作用的影響。

1.3.1 CDDP對HEK293細(xì)胞毒性模型的建立

將200 μL（1×105個/mL）HEK293細(xì)胞接種至96孔板，待細(xì)胞生長至融合 狀態(tài)時，加入不同終質(zhì)量濃度CDDP溶液（0、0.004 7、0.009 4、0.018 8、0.037 5、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2 mg/mL），于37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每組6個復(fù)孔。向上述96孔培養(yǎng)板中加入終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL噻唑藍(lán)，于 37℃、5% CO2孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄廢液并加入二甲基亞砜（150 μL/孔），混勻10 min，酶標(biāo)儀檢測（測定波長570 nm，參比波長630 nm）吸光度。以不加CDDP組為空白對照，計算細(xì)胞存活率。

式中：A1為實(shí)驗(yàn)組上清液的吸光度；A0為空白對照組上清液的吸光度。

1.3.2 GSPE對HEK293細(xì)胞生長的影響

將200 μL（1×105個/mL）HEK293細(xì)胞接種至96孔板，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時，加入不同終質(zhì)量濃度GSPE（0、0.001、0.002、0.004、0.008、0.016、0.032、0.064、0.128、0.256、0.512、1.024、2.048、4.096、8.192、16.384 mg/mL），于37℃、含5% CO2的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，噻唑藍(lán)比色法測定其吸光度（測定波長570 nm，參比波長630 nm），計算GSPE對HEK293細(xì)胞生長存活率影響。每組6個復(fù)孔。

1.3.3 GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞毒性的保護(hù)作用

將200 μL（1×105個/mL）HEK293細(xì)胞接種至96孔板，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時，將細(xì)胞分組為：空白對照組（僅用含10%新生牛血清的MEM進(jìn)行培養(yǎng)）；CDDP模型組（終質(zhì)量濃度0.015 mg/mL）；CDDP+GSPE組：加0.015 mg/mL CDDP前30 min加入不同終質(zhì)量濃度的GSPE（終質(zhì)量濃度分別為0.008、0.016、0.032、0.064、0.128、0.256、0.512、1.024 mg/mL）。于37℃、含5% CO2孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，噻唑藍(lán)比色法測定其吸光度，計算GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞存活率變化。每組6個復(fù)孔。

1.4 GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞凋亡的測定

按1.2節(jié)所述方法對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，至細(xì)胞生長至融合狀態(tài)后，將所培養(yǎng)細(xì)胞分為：空白對照組（僅用含10%新生牛血清的MEM進(jìn)行培養(yǎng)）；CDDP模型組（CDDP終質(zhì)量濃度0.015mg/mL）；0.015 mg/mL CDDP+0.512mg/mL GSPE組；0.015 mg/mL CDDP+1.024 mg/mL GSPE組，GSPE處理組在加入CDDP前30 min加入，藥物組加藥時其他相應(yīng)組加入同體積生理鹽水或雙蒸水。將各組細(xì)胞于37℃、含5% CO2孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h進(jìn)行細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。

1.4.1 Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測GSPE對CDDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡率

進(jìn)行HEK293細(xì)胞藥物處理并培養(yǎng)24 h后，將各組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化液制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后取5×105～1×106個細(xì)胞，于4℃磷酸鹽 緩沖溶液中沖洗。將細(xì)胞懸置于200 μL結(jié)合緩沖液中，加入10 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞并輕輕混勻，室溫避光孵育15 min后，再加入300 μL結(jié)合緩沖液（總反應(yīng)體積為500 μL）和5 μL碘化丙啶染色液（加入碘化丙啶前先將細(xì)胞懸液用200目篩網(wǎng)過濾），冰浴避光放置，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。每份樣品檢測1×104個細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，CellQuest軟件分析細(xì)胞凋亡率，結(jié)果用平均凋亡率表示，并用SPSS 12.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

1.4.2 Western blotting檢測GSPE對CDDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞中凋亡蛋白的表達(dá)

收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞蛋白（蛋白含量采用BCA測蛋白法測定），進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、雜交和顯影，分析HEK293細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)。具體操作如下：收集蛋白樣品，5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）上樣緩沖液混勻，100℃煮沸10 min；各組取30 μg樣品蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和轉(zhuǎn)膜。120 V電泳90 min（待溴酚藍(lán)顯現(xiàn)即可終止），100 mA電轉(zhuǎn)1 h后取出膜，Tris-HCl緩沖溶液+吐溫溶 液（TBST）清洗，膜用含5%脫脂乳粉的封閉液10 mL封閉1h，TBST洗3次，再與一抗Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、β-actin（1∶500），4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入二抗（1∶10 000），孵育、洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光法反應(yīng)后暗室中壓片顯影，以β-actin為內(nèi)參，凝膠圖像分析軟件掃描，測定蛋白條帶灰度值。HEK293細(xì)胞中蛋白表達(dá)強(qiáng)度用蛋白條帶灰度與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度比值表示[13]。

1.5 統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，分別測定CDDP、GSPE對 HEK293細(xì) 胞的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（IC50值，并應(yīng)用單因素方差分析判定GSPE對CDDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡以及凋亡相關(guān)基因的影響，顯著性差異以P＜0.05或P＜0.01表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 CDDP所致HEK293細(xì)胞毒性作用

圖1 CDDP所致HEK293細(xì)胞毒性作用Fig.1 Toxic effect of cisplatin on HEK293 cells

如圖1所示，隨CDDP終質(zhì)量濃度升高，HEK293細(xì)胞存活率不斷降低，表明CDDP對HEK293細(xì)胞的抑制程度不斷增大，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系，加入CDDP后培養(yǎng)24 h后測得其對HEK293細(xì)胞的IC50值為（0.015±0.000 3）mg/mL。

2.2 GSPE對HEK293細(xì)胞正常生長的影響

圖2 GSPE對HEK293細(xì)胞生長的影響Fig.2 Effect of GSPE on the growth of HEK293 cells

如圖2所示，隨G S P E終質(zhì)量濃度的升高，HEK293細(xì)胞存活率逐漸增高，在GSPE終質(zhì)量濃度為0.064 mg/mL時，HEK293細(xì)胞存活率達(dá)到最高，此后隨GSPE質(zhì)量濃度增加，HEK293細(xì)胞存活率逐漸降低。加入GSPE后培養(yǎng)24 h后測得其對HEK293細(xì)胞的IC50值為（1.916 5±0.04）mg/mL。

2.3 GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞毒性的保護(hù)作用

圖3 GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞毒性的保護(hù)作用Fig.3 Protective effect of GSPE on cisplatin-induced cytotoxicity on HEK293 cells

如圖3所示，用終質(zhì)量濃度為0.015 mg/mL的CDDP孵育HEK293細(xì)胞24 h建立毒性模型，不同終質(zhì)量濃度GSPE拮抗細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示CDDP建立的HEK293細(xì)胞毒性模型其存活率隨GSPE質(zhì)量濃度升高而增高。其中GSPE質(zhì)量濃度為0.512 mg/mL時，其細(xì)胞存活率達(dá)最大值，而1.024 mg/mL的GSPE其抑制作用略好于0.256 mg/mL GSPE的抑制作用，表明一定質(zhì)量濃度GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選用添加0.512、1.024 mg/mL的GSPE研究其保護(hù)作用。

2.4 GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞凋亡的影響

2.4.1 流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染色法檢測GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞凋亡率的定量分析結(jié)果

圖4為各實(shí)驗(yàn)組其Annexin V/PI雙變量流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖，表1為細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，CDDP可造成HEK293細(xì)胞凋亡率升高（包括早期凋亡和中晚期凋亡），與空白對照組相比具有極顯著性差異（P＜0.01）；而GSPE則可使CDDP所致HEK293細(xì)胞凋亡率升高的程度顯著降低，其中終質(zhì)量濃度為0.512 mg/mL的GSPE比1.024 mg/mL的GSPE的抑制凋亡作用（包括早期凋亡和中晚期凋亡）更佳，表明終質(zhì)量濃度為0.512 mg/mL的GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞凋亡具有更好的拮抗作用，提示GSPE可能參與調(diào)控CDDP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞的凋亡。

圖4 GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞凋亡率的影響Fig.4 Effect of GSPE on CDDP-induced apoptosis rate of HEK293 cells

表1 GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞凋亡率的影響Table 1 Effect of GSPE on cisplatin-induced apoptosis rate of HEK293 cells

2.4.2 Western blotting檢測GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

圖5 GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)量影響Fig.5 Effect of GSPE on cisplatin-induced Bax protein expression in HEK293 cells

圖6 GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)量影響Fig.6 Effect of GSPE on cisplatin-induced Bcl-2 protein expression in HEK293 cells

表2 GSPE對CDDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡基因表達(dá)灰度值的影響Table 2 Effect of GSPE on CDDP-induced apoptosis gene expression in HEK293 cells

如圖5、6和表2所示，CDDP模型組Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)量較空白對照組具有顯著性差異（P＜0.01）；0.015 mg/mL CDDP+0.512 mg/mL GSPE組促凋亡基因Bax蛋白表達(dá)量較CDDP模型組明顯降低，抑凋亡基因Bcl-2明顯升高（P＜0.01），0.015mg/mL CDDP+1.024mg/mL GSPE組促凋亡基因Bax蛋白表達(dá)量亦有降低，但其降低程度不及0.015 mg/mL CDDP+0.512 mg/mL GSPE組，Bcl-2蛋白表達(dá)量升高幅度也低于0.015mg/mL CDDP+0.512 mg/mL GSPE組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GSPE可通過阻抑CDDP所致HEK293細(xì)胞促凋亡基因Bax蛋白表達(dá)量的增加、抑凋亡基因Bcl-2表達(dá)量的減少從而減輕細(xì)胞凋亡，且GSPE終質(zhì)量濃度為0.512 mg/mL效果優(yōu)于1.024 mg/mL。

3 討 論

CDDP所致細(xì)胞毒性最終可引起細(xì)胞壞死，包括凋亡和脹亡。凋亡是由基因介導(dǎo)的主動性細(xì)胞死亡，是一個有許多分子參與的復(fù)雜而有序的過程。研究表明，CDDP所致腎毒性機(jī)制主要由CDDP誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡所致[14-16]。Lieberthal等[17]研究證實(shí)，CDDP可引起原代培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞死亡（包括凋亡和壞死），死亡的形式取決于CDDP的濃度；Park等[18]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度CDDP（8～100 μmol/L）以時間和劑量依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Okuda等[19]發(fā)現(xiàn)30 μmol/L的CDDP誘導(dǎo)LLC-PKl凋亡，并使堿性磷酸酶、γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶活性降低。因此認(rèn)為凋亡在CDDP腎毒性中發(fā)揮著重要的作用，減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡是減輕CDDP腎毒性的一個重要的措施。

細(xì)胞在發(fā)生凋亡的過程中，因胞漿及胞核內(nèi)染色質(zhì)發(fā)生濃縮，細(xì)胞核會發(fā)生裂解從而產(chǎn)生凋亡小體。細(xì)胞是否發(fā)生凋亡與某些凋亡相關(guān)基因的激活表達(dá)密切相關(guān)，Bcl-2、Bax等基因都參與CDDP所致細(xì)胞凋亡過程。研究顯示[19]，CDDP通過引起細(xì)胞氧化損傷，誘發(fā)細(xì)胞毒性，激活各種前凋亡分子包括Caspase 3、Caspase 9、Bax以及Fas系統(tǒng)，啟動線粒體途徑和死亡受體途徑而引起細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族是對Caspases激活進(jìn)行調(diào)控的一類重要蛋白因子，根據(jù)功能分為兩類：一類是抑制細(xì)胞凋亡的蛋白，如Bcl-2、Bcl-XL；另一類是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白，如Bax等。Bcl-2屬原癌基因，編碼26×103的線粒體膜蛋白，是最重要的凋亡抑制基因[20]。Bax是Bcl-2相關(guān)基因家族成員，可與Bcl-2形成異源性二聚體復(fù)合物，對Bcl-2的抗凋亡起抑制作用。促凋亡基因Bax與抗凋亡基因Bcl-2的比值是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵[21]，Bax/Bcl-2比值增加促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)CDDP可引起劑量依賴性前凋亡分子Bax的激活。另有研究者發(fā)現(xiàn)CDDP先誘導(dǎo)Bax分子的激活，再使線粒體膜的通透性增加，細(xì)胞色素c從線粒體釋放，激活Caspase 9，從而啟動線粒體介導(dǎo)的凋亡[22]。在誘導(dǎo)凋亡作用下，Bax構(gòu)象發(fā)生改變，疏水部分暴露，使其從胞漿轉(zhuǎn)移至線粒體，Bax寡聚化在線粒體外膜上形成小孔，使細(xì)胞色素c釋放，后者激活Caspase，從而誘發(fā)凋亡。Bcl-2通過阻止Bax從胞漿到線粒體轉(zhuǎn)移而拮抗Bax的功能，從而抑制細(xì)胞凋亡[23-25]。

GSPE具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、抗炎、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗衰老、抗疲勞、抗過敏、改善視覺、增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶等廣泛的藥理學(xué)作用。體外及動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明，GSPE本身不具有毒性[21]。本實(shí)驗(yàn)室前期已研究證明GSPE可通過調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)拮抗CDDP對HEK293細(xì)胞的氧化損傷作用，本研究則從細(xì)胞凋亡角度進(jìn)一步探究GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞毒性作用的影響。實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀檢測HKE293細(xì)胞凋亡并運(yùn)用Western blotting觀察凋亡相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果顯示，CDDP處理后，HEK293細(xì)胞早、中晚期凋亡率均顯著增加；同時，CDDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡，使得Bcl-2基因表達(dá)明顯降低，Bax基因表達(dá)明顯增加，表明Bcl-2、Bax基因是參與CDDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡的重要原因。此外，也表明細(xì)胞凋亡在CDDP誘發(fā)HEK293細(xì)胞毒性過程中起重要作用。

GSPE拮抗因CDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡其確切的分子機(jī)制目前仍不明確。其中一個可能的解釋即為GSPE對凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。因此，本研究測定并證明了CDDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡以及GSPE拮抗凋亡的作用，顯示GSPE是通過對凋亡相關(guān)基因的調(diào)控來而拮抗細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定終質(zhì)量濃度GSPE與CDDP共同孵育可降低HEK293細(xì)胞凋亡率，增強(qiáng)抗凋亡基因Bcl-2基因表達(dá)量、抑制促凋亡基因Bax表達(dá)，表明GSPE對CDDP所致HEK293細(xì)胞凋亡具有拮抗作用，其作用機(jī)理與GSPE增加抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)、增強(qiáng)細(xì)胞穩(wěn)定性及抵御CDDP侵害的能力、降低促凋亡基因Bax表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡等方面保護(hù)細(xì)胞有關(guān)。

[1] NAGWANI S, TRIPATHI Y B. Amelioration of cisplatin induced nephrotoxicity by PTY: a herbal preparation[J]. Food and Chem Toxicology, 2010, 48(8/9): 2253-2258.

[2] YU Yingnan, CHEN Hui, LI Yan. Protect effect of bicyclol on cisplatin-induced nephrotoxicity in mice[J]. Archives of Toxicology, 2009, 83(4): 381-387.

[3] 郭培培, 高麗萍, 冷洪濤, 等. 枸杞多糖對順鉑誘導(dǎo)人胚腎細(xì)胞凋亡的影響[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(7): 284-286.

[4] SCALBERT A, WILLIAMSON G. Dietary intake and bioavilability of polyphenols [J]. J Nutr, 2000, 130(Suppl 8): 2073-2085.

[5] MEERAN S M, KATIYAR S K. Grape seed proanthocyanidins promote apoptosis in human epidermoid carcinoma A431 cells through alterations in Cdki-Cdk-cyclin cascade, and caspase-3 activation via loss of mitochondrial membrane potential[J]. Exp Dermatol, 2007, 16(5): 405-415.

[6] KAUR M, AGARWAL R, AGARWAL C. Grape seed extract induces anoikis and caspase-mediated apoptosis in human prostate carcinoma LNCaP cells: possible role of ataxia telangiectasia mutated-p53 activation[J]. Mol Cancer Ther, 2006, 5(5): 1265-1274.

[7] 池余剛, 鐘玲, 伍霞, 等. 原花青素對卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2008, 30(23): 2203-2206.

[8] ITO H K, KOBAYASHI E, TAKAMATSU Y, et al. Polyphenols from Eriobotrya japonica and their cytotoxicity against human oral tumor cell lines[J]. Chem Pharm Bull, 2000, 48(5): 687- 693.

[9] HU H, QIN Y M. Grape seed proanthocyanidin extract induced mitochondria associated apoptosis in human acute myeloid leukaemia14.3D 10 cells[J]. Chin Med J, 2006, 119(5): 417-421.

[10] KAUR M, SINGH R P, GU M, et al. Grape seed extract inhibits in vitro and in vivo growth of human colorectal carcinoma cells[J]. Clin Cancer Res, 2006, 12: 6194-6202.

[11] 李貞, 高麗萍, 冷洪濤, 等. 葡萄籽原花青素對順鉑所致人胚腎細(xì)胞毒性的拮抗作用[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(7): 315-318.

[12] SAAD A A, YOUSSEF M I, El-SHENNAWY L K. Cisplatin induced damage in kidney genomic DNA and nephrotoxicity in male rats: the protective effect of grape seed proanthocyanidin extract[J]. Food and Chem Toxicol, 2009, 47: 1499-1506.

[13] 禹彬, 許莉, 孫連坤, 等. 人質(zhì)膜型唾液酸酶對丁酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報, 2008, 34(1): 49-52.

[14] 陳曉嵐, 張曉娟, 范亞平, 等. 辛伐他汀對大鼠系膜細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表達(dá)的影響[J]. 中華腎臟病雜志, 2006(22): 109-113.

[15] UEDA N, KAUSHAL G P, SHAH S V. Apoptotic mechanisms in acute renal failure[J]. Am J Med, 2000, 108: 403-415.

[16] HAUSER P, OBERBAUER R. Tubular apoptosis in the pmhophysiology of renal diseases[J]. Wien Klin Wochenschr, 2002, 114: 671-677.

[17] LIEBERTHAL W, TRIACA V, LEVINE J. Mechanism of death induced by cisplatin in proximal tubular epithelial cells: apoptosis vs necrosis[J]. Am J of Physiol Renal Physiol, 1996, 270: 700-708．

[18] PARK M S. Cisplatin induced apoptosis in LLC-PKI cells via activation of mitochondrial pathways[J]. Am Soc Nephrol, 2002, 13: 858-865.

[19] OKUDA M. Role of apoptosis in cisplatin-induced toxicity in the renal epithelial cell line LLC-PKl[J]. Biochem Pharmacol, 2000, 59: 195-201.

[20] FISHER D E. Apoptosis in cancer therapy: crossing the threshold[J]. Cell, 1994, 78: 539-542.

[21] SUGIYAMA H, KASHIHARA N, MAKINO H, et al. Apoptosis in glomerular sclerosis[J]. Kidney Int, 1996, 49(1): 103-111.

[22] WANG Xiaodong. The expanding role of mitochondria in apoptosis[J]. Genes & Dev, 2001, 15: 2922-2933.

[23] WANG Xiaotao, JENNIFER L, MARTINDALE N J. Requriement for ERK activation in cisplatin-induced apoptosis[J]. Biol Chem, 2000, 275: 39435-39443.

[24] MIKHAILOV V, MIKHAILOVA M, DONNA J. Bcl-2 prevents bax oligomerization in the mitochondri AL outer member[J]. Biol Chem, 2001, 276: 18361-18374．

[25] YAMAKOSHI J, SAITO M, KATAOKA S, et al. Safety evaluation of proanthocyanidin-rich extract from grape seeds[J]. Food Chem Toxicol, 2002, 40(5): 599-607.

Protective Effect of Grape Seed Proanthocyanidin Extract against Cisplatin-Induced Apoptosis in Human Embryonic Kidney Cells

GUO Zhuo-yu, GAO Li-ping*, LI Zhen
(Beijing Municipal Key Laboratory of Biological Active Substance and Functional Food, College of Applied Arts and Technology, Beijing Union Univers ity, Beijing 100191, China)

Purpose: To explore the pr otective effect of grape seed proanthocyanidin extract (GSPE) against cisplatin (CDDP)-induced apoptosis in human embryo kidney (HEK) 293 cells and its possible mechanisms. Methods: The effects of CDDP and GSPE on the in vi tro growth of HEK 293 cells and the effect of GSPE o n CDDP-ind uced toxicity was evaluated by MTT assay. CDDP-induced apoptosis in HEK293 cells was analyzed by flow cytometry. Western blotting was applied to determine the expression of apoptotic gene Bax and anti-ap optosis gene Bcl-2. R esults: GSPE was able to antagonize cisplatin-induced cytotoxicity in a concentration-dependent manner. Flow cytometry revealed that GSPE coul d lead to a decrease in apoptosis rate and pro-apoptotic Bax gene expression while anti-apoptotic ge ne Bcl-2 expression was enhanced. Conclus ion: GSPE demonstrat es a preventive effect on cisp latin-induced injury in HEK293 cells. The mechanism may be related to its capacity of enhancing anti-apoptotic gene Bcl-2 expression and inhibiting pro-apoptotic gene Bax expression.

grape seed proanthocyanidin extract; cisplatin; human embryo kidney (HEK) 293 cells; apoptosis

Q946.8

A

1002-6630(2014)01-0234-05

10.7506/spkx1002-6630-201401046

2013-06-29

北京聯(lián)合大學(xué)人才強(qiáng)校計劃人才資助項(xiàng)目（BPHR2011A01）

郭卓雨（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄允称飞饔?。E-mail：guozhuoyu0310@163.com

*通信作者：高麗萍（1962—），女，教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苄允称飞饔?。E-mail：gaolip62@163.com