杜 蕾，李新華*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

黑、紅花生衣中原花色素的分析

杜 蕾，李新華*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

對黑、紅花生衣中的原花色素成分進行考察。通過乙醇溶液提取、有機溶劑萃取分離以及大孔樹脂純化的方法對花生衣色素成分進行分離制備，采用高效液相色譜法對色素中原花色素的含量進行測定，并應用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術對原花色素成分的組成進行鑒定。黑、紅花生衣色素中原花色素的含量分別為29.19%和43.04%。依據(jù)質(zhì)譜信息初步鑒定出紅花生衣中含有4種原花色素二聚體和4種原花色素三聚體，黑花生衣中含有3種原花色素二聚體和4種原花色素三聚體。該法測定原花色素含量簡便、快捷，可以較好的鑒定花生衣中原花色素的主要成分。

原花色素；高效液相色譜法；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；黑花生衣；紅花生衣

原花色素（proanthocyanidins，PC）是自然界廣泛存在的一類酚類化合物的總稱，由兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯和沒食子酸等單體以及這些單體通過C4—C6、C4—C8鍵結(jié)合而成的低聚體和高聚體等組成的混合物。通常將二～四聚體稱為低聚原花色素（oligomeric proanthocyanidins，OPC），將四聚體以上的稱為高聚原花色素（polymeric proanthocyanidins，PPC）[1-2]。低聚原花色素具有清除自由基、抗氧化、護心腦血管、抗炎癥、抑制腫瘤等生物活性，已用于保健食品、日用化學品和制藥等領域[3]。

花生衣作為花生加工的副產(chǎn)物，產(chǎn)量很大，主要用于飼料、燃料[4]，但目前還沒有開發(fā)出其經(jīng)濟價值。據(jù)報道，花生衣中含有原花色素低聚物、白藜蘆醇及花色苷等功能成分[5-8]，具有清除自由基、抗氧化、抑菌等活性[9-12]。目前，花生衣中原花色素的報道多見于紅花生[13-16]，黑花生衣中花色苷成分的報道較多[17-20]，而原花色素具體成分的報道還很少見。

測定原花色素含量的主要方法有分光光度法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[21]，HPLC法具有出色的分離和定量分析性能，被應用于葡萄籽、蕎麥、葡萄酒、爬山虎等一系列植物提取物中原花色素的研究。對于原花色素結(jié)構鑒定，目前主要采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-mass spectrometry，HPLC-MS）技術，利用HPLC技術對原花色素組分的高分辨率分離以及MS所提供的結(jié)構信息，可以對樣品中的原花色素成分進行鑒定分析，已經(jīng)在葡萄籽、蔓越橘、荔枝皮、沙棘籽等提取物的原花色素結(jié)構鑒定中得到了廣泛使用。本研究利用HPLC法測定黑、紅花生衣中原花色素的含量，應用HPLC-MS技術對其原花色素成分進行鑒定，為其以后的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑花生種皮、紅花生（大白沙）種皮 遼寧虹螺健康食品企業(yè)有限公司；AB-8大孔樹脂 南開大學化工廠；原花色素B2對照品 成都曼斯特生物科技有限公司；無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、甲酸（均為色譜純）天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

2487高效液相色譜儀（配有1525二元泵、2487檢測器、Breeze 3.0色譜工作站） 美國Waters公司；1100系列LC-Trap SL高效液相色譜-質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；BSA224S電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；DZF-6050真空干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；DHL-A電腦恒流泵 上海青浦滬西儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 花生衣色素的制備

準確稱取10.00 g花生皮，不經(jīng)粉碎，加入500 mL 50%乙醇溶液（V/V），35 ℃條件下超聲波輔助提取15 min，冷卻后抽濾，收集提取液，殘渣中再加入500 mL提取劑，重復提取3次，合并提取液，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，濃縮液用石油醚萃取3次以除去可能存在的脂溶性雜質(zhì)。水相部分稀釋為2.0 mg/mL，過AB-8大孔樹脂進行純化，洗脫液減壓濃縮、真空干燥后，收集備用。

1.3.2 原花色素標準溶液的配制

精確稱取原花色素標準品2.0 mg，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度200 ?g/mL的原花色素標準溶液，過0.45 ?m微孔濾膜。精密吸取0.5 mL原花色素標準溶液，加入0.5 mL經(jīng)過0.45 ?m微孔濾膜過濾后的甲醇溶液，配成質(zhì)量濃度為100 ?g/mL的標準液，按上述方法配成質(zhì)量濃度50、25、12.5、6.25 ?g/mL的標準溶液。

1.3.3 原花色素含量測定

分別精確稱取黑、紅花生衣色素1.0 mg，用1 mL甲醇溶解，過0.45 ?m微孔濾膜，采用HPLC測定原花色素的含量。

色譜柱：ODS-2 Hypersil （150 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：甲醇-0.5%甲酸（90∶10，V/V）；檢測波長280 nm；進樣量5 μL；流速0.7 mL/min。

1.3.4 原花色素的組成測定

分別稱取黑、紅花生衣色素0.5 g，于少量水中充分溶解，加入2倍體積乙酸乙酯溶液萃取，重復操作5次。花色苷等極性較大的成分溶于水相中被分離，合并乙酸乙酯相，減壓濃縮、真空干燥后，精確稱取1.0 mg，用1 mL甲醇溶解，過0.45 ?m微孔濾膜，采用HPLC-MS檢測原花色素的組成。

1.3.4.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）；流動相A：甲醇，流動相B：1%甲酸溶液（V/V）；洗脫條件：0～15 min，15%～40%A；15～30 min，40%～90%A；30～35 min，90%A；柱溫30 ℃；流速0.2 mL/min；進樣量5 μL。

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

電噴射離子源；正離子模式；噴射電壓4 500 V；噴射壓力20 psi；干燥氣流速8.0 L/min；干燥氣溫度325 ℃；掃描質(zhì)量范圍m/z 200～900。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生衣色素中原花色素含量的測定

圖1 原花色素標準品（A）、黑花生衣色素（B）、紅花生衣色 素（C）高效液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of proanthocyanidins standard (A), black peanut skin (B) and red peanut skin (C)

以原花色素標準品的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線，得y=8 902.4x＋83 748，在測定范圍內(nèi)標準品質(zhì)量濃度與峰面積呈良好線性關系（R2=0.992 2）。取樣品按照1.3.3節(jié)的制備方法制成供試品溶液、按1.3.3節(jié)色譜條件測定3次，取平均值。原花色素標準品及花生衣色素的HPLC圖譜見圖1。黑花生衣色素中原花色素含量為291.86 ?g/mL，紅花生衣色素中原花色素含量為430.43 ?g/mL，即制得的黑花生衣色素粉末中原花色素含量為29.19%，紅花生衣色素粉末中原花色素含量為43.04%。

2.2 花生衣中原花色素組分的分析

原花色素是一類結(jié)構復雜的化合物，本實驗在電噴射離子源、正離子模式下，對色素溶液進行全掃描，離子流圖如圖2所示。原花色素的特征離子為準分子離子[M＋H]+和失去基團后的碎片離子[M＋H－X]+。根據(jù)一級質(zhì)譜圖確定準分子離子[M＋H]+，以準分子離子為母離子再進行全掃描，得到碎片離子的質(zhì)譜圖即二級質(zhì)譜圖，通過質(zhì)譜信息獲得化合物的準確相對分子質(zhì)量及組成結(jié)構，并與文獻報道[22-25]的原花色素成分進行比較，推測其組成。花生紅衣、黑衣中原花色素組分主要質(zhì)譜信息分別見表1和表2。

圖2 紅花生衣（A）和黑花生衣（B）原花色素的總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatograms of proanthocyanidin extracts of red peanut skin (A) and black peanut skin (B)

圖3 紅、黑花生衣中原花色素的一級質(zhì)譜圖（A～D）和二級質(zhì)譜圖（a～e）Fig.3 MS (A through D) and MS-MS (a through e) chromatograms of proanthocyanidin extracts of red and black peanut skins

如圖3A、a所示，紅花生衣中保留時間為2.1 min的分子離子m/z 865.6通過逆狄爾斯-阿爾德（retro Diels-Alder，RDA）反應得到碎片離子m/z 712.9（M－152）；通過分子間斷裂失去1個T單位（C15H12O6）得到碎片離子m/z 576.8（M－288），碎片離子m/z 576.8繼續(xù)發(fā)生RDA反應得到碎片離子m/z 424.9（M－288－152）；通過分子間斷裂失去1個T單位（C15H12O6）和1個B單位（C15H14O6）得到碎片離子m/z 286.9（M－288－290）。紅花生衣中保留時間為7.7、10.6 min以及黑花生衣中保留時間為2.1、7.8、10.8、12.7 min的組分的質(zhì)譜信息與紅花生衣中保留時間為2.1 min的組分相同，說明此7種組分具有相同的結(jié)構。此化合物相對分子質(zhì)量為864，表明是由3個（表）兒茶素單元構成的三聚體，比B型原花色素三聚體少2個，推斷該化合物可能為A型原花色素三聚體[23]。

如圖3B、b所示，紅花生衣中保留時間為5.8 min的分子離子m/z 866.8通過RDA反應得到碎片離子m/z 712.9（M－152－2H），通過分子間斷裂失去1個B單位（C15H14O6）得到碎片離子m/z 576.7（M－290），碎片離子m/z 576.7繼續(xù)發(fā)生RDA反應得到碎片離子m/z 424.7（M－290－152），通過分子間斷裂失去1個B單位（C15H14O6）和1個T單位（C15H12O6）得到碎片離子m/z 288.8（M－290－288）。此化合物相對分子質(zhì)量為866，表明是由3個（表）兒茶素單元構成的三聚體，推斷該化合物可能為B型原花色素三聚體。

如圖3B、c所示，紅花生衣中保留時間為5.8 min的分子離子m/z 579.2失去1個間苯三酚（C6H6O3）得到碎片離子m/z 452.8（M－126），通過RDA反應得到碎片離子m/z 427.0（M－152），碎片離子m/z 427.0繼續(xù)失去1分子水（H2O）得到碎片離子m/z 408.9（M－152－18），通過分子間斷裂失去1個T單位（C15H12O6）得到碎片離子m/z 290.9（M－288）。黑花生衣中保留時間為5.7 min組分的質(zhì)譜信息與紅衣中保留時間5.8 min組分相同，說明此2種組分具有相同的結(jié)構。此化合物相對分子質(zhì)量為578，表明是由2個（表）兒茶素單元構成的二聚體，推斷該化合物可能為B型原花色素二聚體。

如圖3C、d所示，紅花生衣中保留時間為7.7 min的分子離子m/z 579.1通過RDA反應得到碎片離子m/z 426.9（M－152），碎片離子m/z 426.9繼續(xù)失去1分子水（H2O）得到碎片離子m/z 408.8（M－152－18）；通過分子間斷裂失去1個B單位（C15H14O6）得到碎片離子m/z 288.9（M－290）。黑花生衣中保留時間為7.9 min的組分的質(zhì)譜信息與紅衣中保留時間為7.7 min的組分相同，說明此2種組分具有相同的結(jié)構。此化合物相對分子質(zhì)量為578，表明是由2個（表）兒茶素單元構成的二聚體，推斷該化合物可能為B型原花色素二聚體。

如圖3D、e所示，紅花生衣中保留時間為16.4 min的分子離子m/z 576.9通過RDA反應得到碎片離子m/z 424.9（M－152）；通過分子間斷裂失去1個B單位（C15H14O6）得到碎片離子m/z 287.0（M－290）。紅花生衣中保留時間為19.8 min以及黑花生衣中保留時間為16.6 min組分的質(zhì)譜信息與紅花生衣中保留時間為16.4 min的組分相同，說明此3種組分具有相同的結(jié)構。此化合物相對分子質(zhì)量為576，表明是由2個（表）兒茶素單元構成的二聚體，比B型原花色素二聚體少2，推斷該化合物可能為A型原花色素二聚體[23]。

表1 紅花生衣中的原花色素種類Table 1 Proanthocyanidins identified in red peanut skin

表2 黑花生衣中的原花色素種類Table 2 Proanthocyanidins identified in black peanut skin

3 結(jié) 論

應用HPLC測定原花色素含量時，標準品與樣品的出峰時間基本一致，說明花生衣色素樣品中含有原花色素成分。由于原花色素及其異構體極性相近，一些原花色素成分沒有分離開而產(chǎn)生重疊峰，或由于其他成分產(chǎn)生的吸收峰，本研究中樣品的峰面積比標準品的更寬、信號更強，說明樣品中含有多種原花色素成分，黑、紅花生衣色素中原花色素的含量分別為29.19%和43.04%。

HPLC-MS聯(lián)用法可以提供各種化合物的結(jié)構信息，成為復雜化合物分析和檢測的有力工具。本實驗應用HPLC-MS技術成功分析了紅、黑花生衣中原花色素組分，在紅花生衣中共得到4種二聚體、4種三聚體；黑花生衣中共得到3種二聚體、4種三聚體。在2種花生衣色素中，某些原花色素具有相同的相對分子質(zhì)量及斷裂方式，出峰時間也基本一致，推測黑、紅花生衣中很可能含有幾種相同的原花色素組分。本研究只對乙酸乙酯提取的花生衣色素溶液中極性較小的原花色素成分進行了鑒定，而花生衣中極性較大的花色苷類物質(zhì)以及其他成分的鑒定還需要進一步研究。

原花色素具有多種生理功效，其中低聚物活性最強。黑、紅花生衣中含有大量的低聚原花色素，可作為功能成分廣泛應用于食品、化妝品以及保健品等領域，不僅提高了花生加工副產(chǎn)物的經(jīng)濟價值，還可以為后期原花色素結(jié)構與功效的研究提供理論依據(jù)。

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Analysis of Proanthocyanidins in Black and Red Peanut Skins

DU Lei, LI Xin-hua*
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

The composition of proanthocyanidins of black and red peanut skins was investigated in this study. The pigment compounds in the skins of black and red peanuts were extracted with ethanol, separated and purified by organic solvent extraction and macroporous resin chromatography. The contents of proanthocyanidins were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) and their composition was qualitatively analyzed by HPLC-mass spectrometry (HPLC-MS). The contents of proanthocyanidins in black and red pigments of peanut skins accounted for 29.19% and 43.04% of total proanthocyanidins, respectively. Four dimmers and 4 trimers of proanthocyanidins were identified in red peanut skin while 3 dimmers and 4 trimers of proanthocyanidins were identified in black peanut skin. This method was simple and fast and could be used for quantitative and qualitative analysis of proanthocyanidins in peanut skins.

proanthocyanidins; high performance liquid chromatography (HPLC); HPLC-mass spectrometry; black peanut skin; red peanut skin

TS255.1

A

1002-6630（2014）04-0190-05

10.7506/spkx1002-6630-201404039

2013-04-06

杜蕾（1986—），女，博士研究生，研究方向為食品制造與貯藏。E-mail：xiaoyuer864vip@126.com

*通信作者：李新華（1955—），男，教授，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品深加工與轉(zhuǎn)化。E-mail：lixh.syau@163.com