史文景，趙其陽，焦必寧,3,*

（1.農(nóng)業(yè)部柑桔產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室（重慶），西南大學柑桔研究所，重慶 400712；2.西南大學園藝園林學院，重慶 400715；3.國家柑桔工程技術研究中心，中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所，重慶 400712）

UPLC-ESI-MS-MS結合QuEChERS同時測定柑橘中的4 種真菌毒素

史文景1,2，趙其陽1，焦必寧1,2,3,*

（1.農(nóng)業(yè)部柑桔產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室（重慶），西南大學柑桔研究所，重慶 400712；2.西南大學園藝園林學院，重慶 400715；3.國家柑桔工程技術研究中心，中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所，重慶 400712）

建立同時檢測柑橘中鏈格孢酚甲基乙醚、交鏈孢酚、騰毒素和橘青霉素4 種真菌毒素的QuEChERS-超高效液相色譜-質譜分析方法。待測樣品經(jīng)乙腈提取，無水MgSO4和NaCl脫水鹽析，C18鍵合相分散萃取凈化，以ACQUITY UPLC BEH C18液相色譜柱為分離柱，以0.1%甲酸溶液和乙腈作為流動相梯度洗脫，在電噴霧離 子源電離、多反應監(jiān)測模式條件下進行測定，外標法定量。該方法在5.0～200 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)（R2）不小于0.992 7，檢出限為0.2～0.7 μg/kg。3 個不同加標水平的平均回收率為78.0%～103.3%，相對標準偏差為2.6%～10.6%。結果表明，該方法快速、準確、靈敏，適用于柑橘中4 種真菌毒素殘留的快速確證檢測。

超高效液相色譜-電噴霧質譜；QuEChERS；柑橘；真菌毒素

鏈格孢屬褐斑病和綠霉病是柑橘貯藏期間的常發(fā)病害，分別是由互隔交鏈孢霉（Alternaria alternata）[1]和指狀青霉（Penicillium digitatum）[2]引起的?；ジ艚绘滄呙鼓墚a(chǎn)生騰毒素（tentoxin，TEN）、鏈格孢酚甲基乙醚（aletrnariol monomethyl ether，AME）和鏈格孢酚（alternario l，AOH）等多種鏈格孢霉毒素[3-4]，指狀青霉是橘青霉素（citrinin，CIT）的重要產(chǎn)生菌之一[5]。這些真菌毒素具有致癌性、細胞毒性、基因毒性等毒性作用[6-8]，對人體健康有潛在的危害。但是，目前我國現(xiàn)行的食品中真菌毒素的限量標準中并未包括鏈格孢霉毒素和橘青霉素[9]，并且我國尚未制定柑橘類水果中真菌毒素檢測的標準方法。因此，建立柑橘類水果中快速、靈敏、準確的真菌毒素檢測方法具有十分重要的意義。

真菌毒素的檢測方法主要有薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）法[10]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[11]、高效液相色譜-質譜（HPLC-tandem mass spectrometry，HPLCMS-MS）法[12-14]、毛細管電泳[15]和免疫學檢測方法[16]等。江濤等[10]利用薄層色譜法測定大米中的橘青霉素，檢出限高于30 μg/kg，靈敏度低。陳月萌等[11]利用高效液相色譜-熒光檢測法測定水果中的3 種鏈格孢霉毒素，方法平均回收率均在78.2%～103.6%，相對標準偏差均小于8.6%，檢出限為2.0～8.0 μg/kg。還有研究者[12-14]利用超高效液相色譜-質譜法分別測定了蘋果汁、橙汁和番茄中的鏈格孢霉毒素，檢出限為0.1～4.0 μg/kg、靈敏度高，前處理步驟分別采用PS DVB固相萃取柱、凝膠色譜和Bond Elut Plexa固相萃取柱凈化，凈化效果好，但操作較為繁瑣、耗時，且成本高。杜建中等[15]利用毛細管電泳測定霉變食品中的橘青霉素，微量、快速、高效，檢出限為2.1 μg/mL，靈敏度低。但目前還未見有相關同時檢測柑橘水果中的鏈格孢霉毒素和橘青霉素的方法報道。

QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）方法具有回收率高、試劑用量少、簡單、快速等優(yōu)點[17-19]，適用于大量樣品的檢測。超高效液相色譜-質譜法可同時用于定性和定量分析，具有檢出限低、靈敏度高等優(yōu)點[20-22]。本實驗以改進的QuEChERS方法結合超高效液相色譜-電噴霧質譜（ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry，UPLC-ESI-MS-MS）法同時測定柑橘中的騰毒素、鏈格孢酚甲基乙醚、鏈格孢酚和橘青霉素4 種真菌毒素，方法快速、準確、靈敏，適用于柑橘類水果中4 種真菌毒素的確證檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

騰毒素、鏈格孢酚甲基乙醚、鏈格孢酚和橘青霉素標準品 新加坡Pribolab公司；乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、石墨化炭黑（graphitized carbon blacks，GCB）、乙腈和甲醇（色譜純） 上海安譜科學儀器有限公司；無水硫酸鎂（分析純） 江蘇強盛化工有限公司；氯化鈉（分析純）國藥集團化學試劑有限公司；C18鍵合相 大連思譜精工有限公司；甲酸（分析純） 重慶川東化工有限公司。

Quatrro-Premier XE超高效液相色譜-質譜儀、Acquity UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；KS260搖床、Vortex Genius 3渦旋混合器德國IKA公司；3K15離心機 德國Sigma公司；MDF-382E（N）超低溫冰箱 日本三洋公司；Milli-Q A10超純水器 美國Millipore公司；0.22 μm有機濾膜 中國捷盛依科科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

標準貯備液：取真菌毒素標準品1 mg，用乙腈溶解并定容至25 mL，得到40 mg/L的真菌毒素母液，置于－50 ℃保存。

標準工作液：分別配制2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 mg/L和0.05 mg/L的4種真菌毒素的混合溶液，置于－50 ℃保存。

基質空白標準工作溶液：以不含真菌毒素的柑橘果實為材料，利用本實驗前處理方法分別制備柑橘果皮、全果和果肉的基質空白溶液。用基質空白溶液將標準工作液按相同比例稀釋至0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/L和0.005 mg/L，分別得到柑橘果皮、全果和果肉基質空白標準工作溶液。

1.2.2 樣品提取和凈化

準確稱取柑橘全果、果肉和果皮樣品各10 g（準確至0.01 g），加入乙腈10 mL（準確至0.01 mL），搖床振蕩提取30 min（300 r/min）；加入3.0 g無水MgSO4和1.0 g NaCl，劇烈振蕩1 min，離心（4 000 r/min，5 min）；取上清液2.0 mL，加入30 mg C18，渦旋3 min，離心（4 000 r/min，5 min）；0.22 μm有機濾膜過濾，UPLC-ESI-MS-MS分析。

1.2.3 儀器實驗條件

1.2.3.1 UPLC條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18液相色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫30 ℃；流動相體系為0.1%甲酸溶液和乙腈；梯度洗脫程序：在0～5 min，乙腈由20%線性遞增至80%，保持2 min，在0.1 min內(nèi)恢復至20%，并保持1 min；進樣量：3 μL；流速：0.3 mL/min。

1.2.3.2 質譜條件

離子化模式：電噴霧離子源，正離子模式（ESI＋）和負離子模式（ESI－）；質譜掃描方式：多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；電離電壓3 kV，離子源溫度120 ℃，脫溶劑溫度360 ℃，脫溶劑氣流量800 L/h，碰撞氣流量0.2 L/min，錐孔反吹氣流量50 L/h。4種真菌毒素的監(jiān)測離子、錐孔電壓和碰撞電壓等質譜參數(shù)如表1所示。

表1 4 種真菌毒素的串聯(lián)質譜測定參數(shù)Table1 MS-MS parameters for four mycotoxins

2 結果與分析

2.1 改進QuEChERS方法

2.1.1 除水劑用量的優(yōu)化

QuEChERS方法以無水MgSO4為除水劑，并結合NaC l的鹽析作用，除去樣品中的水分和雜質，使目標物能夠充分溶解在有機相中。本實驗考察了無水MgSO4用量對添加回收率的影響，如圖1所示，當無水MgSO4的用量為2.0～3.0 g時，4種真菌毒素的添加回收率均上升，并且在無水MgSO4的用量為3.0 g時，4種真菌毒素的添加回收率均較理想；在3.0～5.0 g范圍內(nèi)，鏈格孢酚和橘青霉素的添加回收率降低，騰毒素和鏈格孢酚甲基乙醚的添加回收率變化不大。因此，選取無水MgSO4的用量為3.0 g。

圖1 無水MgSO4用量對4 種真菌毒素回收率的影響（加標量0.1 mg/kg）Fig.1 Effect of anhydrous MgSO4amount on the recoveries of four mycotoxins (at spiked level 0.1 mg/kg)

2.1.2 凈化劑及用量優(yōu)化

GCB、PSA、C18是QuEChERS方法常用的凈化劑，本實驗考察3種凈化劑及其用量對4 種真菌毒素添加回收率的影響。GCB主要用于凈化色素含量較高的樣品，以GCB作為凈化劑，4 種真菌毒素的添加回收率均低于70%；以PSA作為凈化劑，騰毒素、鏈格孢酚甲基乙醚和鏈格孢酚 均能得到較好的添加回收率，但是橘青霉素添加回收率低，并且隨著PSA用量增加，回收率下降；以C18作為凈化劑，4 種真菌毒素均能得到良好的添加回收率。如圖2所示，當C18用量為30 mg時，4 種真菌毒素的添加回收率最為理想。

圖2 C18用量對4 種真菌毒素回收率的影響（加標量0.1 mg/kg）Fig.2 Effect of C18dose on the recoveries of four mycotoxins (at spiked level 0.1 mg/kg)

2.1.3 提取時間的優(yōu)化

本實驗以乙腈作為提取劑，以振蕩提取作為提取方法，考察提取時間對于4 種真菌毒素添加回收率的影響。如圖3所示，當提取時間為15～30 min時，4 種真菌毒素的添加回收率均有所提高，其中鏈格孢酚甲基乙醚最為明顯；當提取時間大于30 min，4 種毒素的添加回收率的提高并不明顯。因此，本實驗確定提取時間為30 min。

圖3 提取時間對4 種真菌毒素回收率的影響（加標量0.1 mg/kg）Fig.3 Effect of extraction time on the recoveries of four mycotoxins (at spiked level 0.1 mg/kg)

2.2 色譜和質譜條件的優(yōu)化

本實驗比較了水-甲醇、水-乙腈、甲酸溶液-甲醇、甲酸溶液-乙腈4 種流動相體系，結果表明以甲酸溶液-乙腈作為流動相體系，4 種真菌毒素的離子信號值增強，且峰形得到明顯改善。確定流動相體系為甲酸溶液-乙腈后，進一步優(yōu)化了甲酸的用量，實驗表明甲酸加入量為0.1%時，出峰效果最佳。

采用流動注射泵連續(xù)進樣方式進行質譜條件的優(yōu)化，分別在ESI＋模式和ESI－模式下進行全掃描，確定騰毒素、鏈格孢酚甲基乙醚和鏈格孢酚在負離子模式下的靈敏度更高，確定3 種真菌毒素的母離子分別是m/z 413.32、m/z 271.02和m/z 257.02；橘青霉素在正離子模式下的靈敏度高于負離子模式，確定其母離子為m/z 250.7。通過對毛細管電壓、錐孔電壓、脫溶劑溫度、碰撞電壓、碰撞壓力等質譜參數(shù)的優(yōu)化，每一種真菌毒素均產(chǎn)生多個子離子，并從中各篩選出豐度強、干擾小的兩對離子對作為監(jiān)測離子對，以豐度最強的離子對作為定量離子對（表1），圖4為1 mg/L標準溶液中4 種真菌毒素的MRM子離子質譜圖。

圖4 騰毒素、鏈格孢酚、鏈格孢酚甲基乙醚和橘青霉素的MRM子離子質譜圖Fig.4 Mass spectra of tentoxin, alternariol methyl ether, alternariol, and citrinin

2.3 方法的評價

2.3.1 線性關系和檢出限

利用UPLC-ESI-MS-MS測定復雜基質樣品時，基質效應會影響方法的準確性，降低方法的靈敏度[23]?；|空白標準工作溶液使得標準溶液和樣品溶液的離子化條件相同，從而減弱基質效應，因此采用基質空白標準工作溶液制作標準曲線。如表2所示，騰毒素、鏈格孢酚甲基乙醚、鏈格孢酚和橘青霉素均在5.0～200 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關系，R2不小于0.992 7。以3 倍信噪比（RSN）計，騰毒素、鏈格孢酚甲基乙醚、鏈格孢酚和橘青霉素的檢出限均低于0.2～0.7 μg/kg。

表2 4 種真菌毒素的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)（R2）和檢出限Table2 Liner ranges, linear equations, correlation coefficients (R2) and limits of detection (LODs) for four mycotoxins

2.3.2 加標回收率和精密度

按1.2.2節(jié)方法分別制備果皮、果肉和全果樣品，添加10、50、100 μg/kg 3 個水平的4 種真菌毒素，每個添加水平重復測定5 次。4 種目標物質在3 個加標水平的平均回收率為78.0%～103.3%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為2.6%～10.6%（表3），具有較高的回收率和精密度。

表3 柑橘果皮、果肉以及全果中4 種真菌毒素的添加回收率和精密度（n=5）Table3 Recovery rates and precision for four spiked mycotoxins in citrus peel, pulp and whole fruits (n=5)

2.3.3 實際樣品測定

從冷庫貯藏果中抽取100 個柑橘樣品，按1.2.2節(jié)方法分別制備果皮、果肉和全果，UPLC-MS-MS分析（圖5）。由表4可知，15 份柑橘果皮樣品呈陽性，4 種真菌毒素含量在1.0～26.6 μg/kg之間，檢出率在5.0%～11.0%之間；7 份全果樣品呈陽性，4 種真菌毒素的含量在1.5～8.3 μg/kg之間，檢出率在1.0%～5.0%之間；3 份果肉樣品被檢測出鏈格孢酚甲基乙醚，含量在2.5～6.0 μg/kg之間，其他3 種真菌毒素均未被檢出。

圖5 柑橘果肉（a）、全果（b）和果皮（c）實際樣品的總離子色譜圖Fig.5 Total ion chromatograms of citrus pulp (a), whole fruit (b) and peel (c)

表4 實際樣品的檢測結果Table4 Contents of four mycotoxins in real samples

3 結 論

本實驗建立了UPLC-ESI-MS-MS結合改進的QuEChERS方法快速測定柑橘中騰毒素、鏈格孢酚甲基乙醚、鏈格孢酚和橘青霉素4 種真菌毒素的方法，方法快速、靈敏、準確，檢出限低，重復性好，能夠在8 min內(nèi)完成檢測。利用該方法檢測柑橘中的4 種真菌毒素，平均回收率為78.0%～103.3%，相對標準偏差為2.6%～10.6%，符合真菌毒素檢測的要求，適用于柑橘類樣品的快速確證檢測。

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Simultaneous Determination of Four Mycotoxins in Citrus Fruits by Ultra Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry Combined with Modified QuEChERS

SHI Wen-jing1,2, ZHAO Qi-yang1, JIAO Bi-ning1,2,3,*
(1. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Citrus Products, Ministry of Agriculture, Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712, China; 2. College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715, China; 3. National Citrus Engineering Research Center, Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712, China)

A method was developed for simultaneous determination of four mycotoxins (aletrnariol monomethyl ether, tentoxin, alternariol, and citrinin) in citrus fruits using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry combined with optimized QuEChERS. Samples were extracted with acetonitrile, salted out with anhydrous MgSO4and NaCl, cleaned up with C18and then analyzed using UPLC-MS-MS in multiple reaction monitoring (MRM) mode with electrospray ionization. The separation of the target mycotoxins was performed on an ACQUITY UPLC BEH C18liquid chromatography column through gradient elution using a mobile phase consisting of acetonitrile and 0.1% formic acid aqueous solution and the matrix-matched external standard calibration was used for quantitation. This method had a good linearity in the concentration range of 5.0-200 μg/L with correlation coefficients (R2) more than 0.992 7, and the limit of detection of the established method was in the range of 0.2-0.7 μg/kg. The average recoveries of the four mycotoxins in different matrixes (citrus pulp, peel and whole fruit) at three spiked levels ranged from 78.0% to 103.3%, with relative standard deviations (RSDs) of 2.6%-10.6%. This method is simple, quick, accurate, sensitive, and suitable for the quick confirmation and quantitative determination of the four mycotoxins in citrus fruits.

ultra-high liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry; QuEChERS; citrus; mycotoxins

TS207.3

A

1002-6630（2014）20-0170-05

10.7506/spkx1002-6630-201420034

2013-11-11

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（柑桔）產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（CARS-27）；“十一五”國家科技支撐計劃項目（2007BAD47B07；2007BADB7B04）；2014年國家柑桔產(chǎn)品質量安全風險評估項目（GJFP2014003）；農(nóng)業(yè)部無公害農(nóng)產(chǎn)品質量安全監(jiān)測項目

史文景（1989—），男，碩士研究生，研究方向為果品營養(yǎng)與安全。E-mail：shiwenjing001@126.com

*通信作者：焦必寧（1964—），男，研究員，本科，研究方向為果蔬質量安全及檢測技術。E-mail：bljiao@tom.com