何恩鵬，湯莉莉，郭玉江

亞精胺對小鼠骨骼肌自由基代謝影響及抗疲勞的效果研究

何恩鵬，湯莉莉，郭玉江

（新疆師范大學運動人體科學重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054）

目的：研究亞精胺（spermidine，SPD）對骨骼肌自由基 代謝的影響以及抗疲勞作用。方法：實驗分為生理鹽水組、SPD低劑量組（0.5 mmol/（kg·d））、中劑量組（1.0 mmol/（kg·d））、高劑量組（1.5 mmol/（kg·d））以及西洋參口服液陽性對照組（總皂苷30 mg/（kg·d）），每周灌胃6 d共30 d，每次灌胃前稱量小鼠體質(zhì)量調(diào)整灌胃溶液量，灌胃期間進行每天45 min無負重游泳訓練。各組隨機選取10只小鼠測試力竭游泳時間；各組剩余10只負重游泳30 min，休息30 min后取材，檢測血清肌酸激酶（creatine kinase，CK）、骨骼肌谷胱甘肽-過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、總超氧化物歧化酶（total-superoxide dismutase，T-SOD）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）活性和骨骼肌丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。結果：與生理鹽水組比較，SPD能顯著延長小鼠力竭游泳時間（P＜0.05）；低、中劑量組骨骼肌中GSH-Px、T-SOD、SDH酶活性顯著提高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）；SPD組與西洋參組比較，低、中劑量抗疲勞效果有非常顯著性（P＜0.05）差異，高劑量抗疲勞效果略優(yōu)（P＞0.05）。結論：0.5～1.0 mmol/（kg·d） SPD可以增加抗氧化酶的活性，減少自由基的積累，提高骨骼肌細胞膜代謝能力和抗損傷能力，顯著推遲小鼠疲勞發(fā)生。

亞精胺；疲勞；谷胱甘肽-過氧化物酶；丙二醛；琥珀酸脫氫酶

疲勞是一種復雜的生理現(xiàn)象，疲勞的積累可造成機體內(nèi)分泌紊亂、免疫力低下，嚴重威脅人類健康，因此如何推遲疲勞發(fā)生逐漸成為研究熱點。研究證實，體內(nèi)氧自由基及其引起的脂質(zhì)過氧化反應可以攻擊細胞及線粒體等生物膜，造成線粒體鈣循環(huán)失調(diào)，之后通過影響基質(zhì)內(nèi)的酶系統(tǒng)而使細胞能量轉(zhuǎn)換功能降低是導致疲勞發(fā)生的重要途徑之一[1]。

亞精胺（spermidine，SPD）是一類含氨基的三價陽離子脂肪胺化合物，能夠跨越臨界距離以靜電作用方式與細胞內(nèi)的多聚陰離子，如核酸、蛋白質(zhì)和 ATP 等，實現(xiàn)可逆的相互作用[2-3]，所有原核和真核物種中都含有亞精胺[4]，亞精胺主要分布于哺乳動物細胞的細胞質(zhì)中，細胞核中也含有少量亞精胺。亞精胺是細胞生長、分化和死亡的關鍵性調(diào)節(jié)者，同時還是DNA、RNA和生物膜的穩(wěn)定因子，還可作為抗氧化劑、 營養(yǎng)素以及第二信使[5-7]。Eisen berg等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在人類衰老細胞中亞精胺濃度出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，同時，亞精胺可以強烈的抵抗衰老小鼠的氧化應激，人為減少細胞內(nèi)源性亞精胺含量會造成細胞氧化應激加強，自由基累積，從而加速細胞死亡。

亞精胺可以通過減少細胞內(nèi)自由基的積累進而減少氧化應激對機體的損害，那么亞精胺是否可以通過此作用機制推遲疲勞的發(fā)生？查閱文獻未見亞精胺在疲勞發(fā)生中作用的相關報道，為了研究其在疲勞發(fā)生中的作用，本實驗從亞精胺對長期從事體育鍛煉小鼠骨骼自由基清除酶和自由基產(chǎn)生影響著手研究，探討亞精胺在疲勞消除中的關鍵作用，并對其抗疲勞效果進行系統(tǒng)評價，為亞精胺成為抗疲勞補劑開發(fā)及應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康昆明系小鼠，清潔級，體質(zhì)量（20±2）g，雄性，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（新）2011-0004。常規(guī)分籠喂養(yǎng)，國家標準嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，自由進食和飲水（純凈水），室內(nèi)相對濕度40%～55%，溫度21～4℃，光照時間l2 h。

小鼠被隨機分成生理鹽水組、亞精胺低劑量組（0.5mmol/（kg·d））、中劑量組（1mmol/（kg·d））、高劑量組（1.5 mmol/（kg·d））以及西洋參口服液陽性對照組（總皂苷30 mg/（kg·d））5組，每組20只，共計100只，被試濃度的確定根據(jù)Eisenberg等[8]的研究確定。

1.2 試劑與儀器

亞精胺 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；肌酸激酶（creatine kinase，CK）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、總超氧化物歧化酶（totalsuperoxide dismutase，T-SOD）、谷胱甘肽-過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

Biospectrometer basic分光光度計 德國Eppendorf公司。

1.3 受試液配制方法和濃度

取14.525 g亞精胺（Mr=145.25）加入生理鹽水定容至1 000 mL，配成100 mmol/L高濃度被試液，后繼續(xù)用生理鹽水稀釋成60 mmol/L和30 mmol/L被試液，以保證每組灌胃藥物體積相等。

1.4 運動方案及藥物服用方法

小鼠適應性飼養(yǎng)2 d，適應性游泳訓練3 d，之后所有動物均采用無負重方式每天游泳鍛煉45 min，每周鍛煉6 d休息1 d，共計游泳鍛煉30 d，鍛煉期間每天灌胃1次，每次灌胃前稱量小鼠體質(zhì)量調(diào)整灌胃溶液量，生理鹽水組灌胃等體積生理鹽水，中午灌胃下午鍛煉。

1.5 小鼠力竭游泳時間測試

于末次給藥30 min后，每組隨機選取小鼠10只，尾根部負其體質(zhì)量5%的鉛皮，放入水溫為30℃水深35 cm的泳箱中[9]。參照Mcardle推薦的力竭判斷標準，即小鼠頭部沉入水中，經(jīng)10 s仍不能返回水面視為力竭。記錄游泳開始至力竭的時間作為小鼠力竭游泳時間。

1.6 樣品的制備

1.6.1 血清的制備

末次給藥30 min后，每組選10只小鼠，在其尾根部負小鼠體質(zhì)量5%的鉛皮，放入30℃、水深35 cm的泳箱中，40 min后取出，休息30 min后摘眼球取血，于1.5 mL離心管中常溫放置2 h，再放入4℃冰箱過夜，吸取血清－20℃保存。

1.6.2 肌肉組織勻漿的制備

準確稱量小鼠骨骼肌2 g，加入9倍體積的勻漿液，冰浴下勻漿機勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清分裝－20℃保存。具體測定方法按照試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以x±s示，組間均數(shù)差異采用單因素方差分析中的最小顯著差數(shù)法（least significant difference，LSD）進行統(tǒng)計學比較，P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結果與分析

2.1 亞精胺對小鼠體質(zhì)量和游泳時間的影響

由表1可知，各組動物實驗初期體質(zhì)量均無顯著差異（P＞0.05），末期亞精胺組小鼠體質(zhì)量增長較快，但與生理鹽水組相比均未見顯著差異（P＞0.05）。與生理鹽水組相比，亞精胺低、中、高劑量組力竭運動時間均顯著提高（P＜0.05）；與西洋參組比較，低、中劑量組亦表現(xiàn)出較強的抗疲勞效果（P＜0.05）；同時，隨著亞精胺濃度的升高，運動時間出現(xiàn)降低的現(xiàn)象，但低劑量組與中劑量組差異不顯著（P＞0.05）。

表1 小鼠體質(zhì)量和游泳時間的比較Table 1 Effect of SPD on body weight and swimming time of mice

2.2 亞精胺對小鼠骨骼肌GSH-Px、T-SOD活力和MDA含量的影響

表2 亞精胺對小鼠骨骼肌GSH-Px、T-SOD活力和MDA含量的影響Table 2 Effect of SPD on GSH-Px, T-SOD and MDA in skeletal muscle of mice

由表2可知，就小鼠骨骼肌GSH-Px、T-SOD活性而言，SPD低、中劑量組顯著高于生理鹽水組（P＜0.05），高劑量組亦高于生理鹽水組（P＜0.05）；與西洋參組比較，SPD低、中劑量組酶活性升高明顯（P＜0.05），高劑量組略微升高，但差異不顯著（P＞0.05）；SPD組間比較，低、中劑量組之間提升酶活性能力無顯著差異（P＞0.05），低劑量組則顯著優(yōu)于高劑量組，差異有顯著性（P＜0.05）。

SPD組骨骼肌MDA含量均顯著少于生理鹽水組（P＜0.05）；SPD低劑量組消除MDA能力優(yōu)于西洋參組（P＜0.05），中、高劑量組則與西洋參組相比無顯著差異（P＞0.05）；SPD組間也無差異。

2.3 亞精胺對小鼠骨骼肌SDH和血清總CK含量的影響

表3 亞精胺對小鼠骨骼肌SDH活力和血清總CK活力的影響Table 3 Effect of SPD on skeletal muscle SDH and serum total CK in mice

由表3可知，SPD組骨骼肌SDH活性較生理鹽水組高，低、中、高劑量組均有顯著差異（P＜0.05）；SPD組與西洋參組相比，差異不顯著（P＞0.05）。

SPD組血清總CK含量較生理鹽水組低，差異顯著（P＜0.05）；與西洋參組相比，SPD低、中劑量組差異顯著（P＜0.05），高劑量組則無顯著差異（P＞0.05）；SPD組間比較，低、中劑量組無顯著差異（P＞0.05），低、高劑量組差異顯著（P＜0.05）。

3 討 論

隨著對疲勞研究的不斷深入，科學家發(fā)現(xiàn)疲勞的發(fā)生與身體自由基的損害及代謝產(chǎn)物的堆積有關[23]，Davis等[10]用電子自旋共振技術直接測定亞急性運動直到力竭的大鼠肝、肌肉勻漿中的活性氧自由基信號強度，發(fā)現(xiàn)其較安靜組增加了2～3倍，這些自由基如果得不到及時清除，會催化形成脂質(zhì)過氧化物，最終導致疲勞出現(xiàn)。因此，從天然物質(zhì)中篩選高效、安全的自由基清除劑來延緩疲勞的發(fā)生勢在必行。

3.1 亞精胺對小鼠力竭游泳時間的影響分析

力竭游泳時間被認為是最能直接反映小鼠抗疲勞能力的指標[11]，此次研究顯示亞精胺能夠非常顯著地提高小鼠的力竭游泳時間。眾所周知，西洋參含有人參皂苷，有清除自由基、降低脂質(zhì)過氧化的作用，具有較明顯的抗疲勞和衰老作用[9]，實驗結果顯示亞精胺抗疲勞能力較西洋參組更強，提示亞精胺具有良好的抗疲勞能力。亞精胺組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，隨著亞精胺劑量的提高，運動時間出現(xiàn)下降的趨勢，低劑量組與中劑量組差異不明顯，與高劑量組相比差異非常顯著，說明0.5～1.0 mmol/（kg·d）的亞精胺能夠較好的提高機體的抗疲勞能力，更大劑量的亞精胺不能有效提高小鼠抗疲勞能力。

3.2 亞精胺對骨骼肌自由基清除的效果分 析

細胞內(nèi)自由基清除酶活性的增加是機體消除自由基損害的一個重要標志，已知較為重要的自由基清除酶有GSH-Px、SOD和過氧化氫酶等。GSH-Px是肌細胞內(nèi)一種重要的過氧化物分解酶，主要作用是清除細胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物和H2O2，還原有毒性的過氧化物變成沒有毒性的羥基化合物，同時特異性地催化氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized，GSSG）為還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH），起到保護細胞膜結構與功能完整的作用[12]。SOD是體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)中另一個重要的抗過氧化酶，也是唯一底物為氧自由基的酶，作用是歧化O2－·生成H2O2，阻斷毒性很強的羥自由基產(chǎn)生，關于SOD的報道很多，已經(jīng)肯定了SOD在自由基清除中的地位[13-14]。本實驗結果顯示，亞精胺可以非常顯著的提高小鼠大強度運動后骨骼肌中GSH-Px和T-SOD的活性，其中亞精胺低、中劑量組效果最為明顯，優(yōu)于西洋參組。

高強度或力竭運動后，雖然機體啟動了自由基清除機制，但仍不能完全被清除，過多的自由基會攻擊生物膜上多元不飽和脂肪酸進而產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物。脂質(zhì)過氧化物可以引起生物膜的功能障礙，表現(xiàn)為膜通透性改變、細胞內(nèi)外物質(zhì)轉(zhuǎn)紊亂，進而表現(xiàn)為線粒體功能、肌纖維興奮收縮偶聯(lián)紊亂、氧代謝能力減弱、ATP生成減少等諸多生理反應。MDA是自由基引起脂質(zhì)過氧化代謝的最終產(chǎn)物，其含量多少直接反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平和抗氧化系統(tǒng)能力的強弱，MDA水平增高，說明體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應加大，細胞膜及線粒體等損傷加劇[15-16]。本研究結果顯示，與生理鹽水對照組比較，亞精胺可 以有效清除骨骼肌產(chǎn)生的MDA，低劑量組亞精胺較西洋參組骨骼肌MDA含量亦顯著減少。可見，亞精胺可以有效增強細胞內(nèi)自由基清除酶的活性，對抗自由基的產(chǎn)生，減少過氧化物質(zhì)的生成，對維持細胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定具有重要作用。

3.3 亞精胺對生物膜保護和骨骼肌有氧代謝能力的作用分析

運動后血清CK活性變化與骨骼肌損傷之間存在一定相關性，肌細胞破壞程度越大，釋放入血的CK就越多，因此血清CK活性水平成為反映骨骼肌損傷程度的重要指標[17]。有研究[18]發(fā)現(xiàn)人體血清CK活性隨著年齡的增長而升高。另外，較少運動的老年人安靜血清CK活性水平較多運動者顯著增高，這與衰老過程中機體自由基含量增加不謀而合，推測自由基對細胞膜的侵害導致是血清CK含量上升的主要因素，張?zhí)N琨等[19]的實驗也證實，力竭游泳后小鼠骨骼肌內(nèi)自由基生成增多，脂質(zhì)過氧化物水平隨之顯著升高，導致肌細胞膜通透性改變，血清肌酸激酶活性明顯升高。本研究發(fā)現(xiàn)，亞精胺組力竭游泳運動后，血清CK增長率較對照組顯著降低，且與細胞MDA含量成正相關，可見血清CK含量與MDA對細胞的侵害有關，推測亞精胺對自由基的清除進而保護生物膜的完整性是血清CK活性降低的作用機理。

SDH是三羧酸循環(huán)中一個關鍵性酶限速酶，它屬于線粒體內(nèi)膜嵌入酶，SDH活性的改變反映了線粒體的功能變化，通常用來評價線粒體的有氧氧化能力。線粒體是氧自由基攻擊的主要細胞器，線粒體膜功能損壞表現(xiàn)為SDH功能下降，該研究顯示，亞精胺可以有效抑制SDH酶活性的降低，說明亞精胺可以阻止生物膜的脂質(zhì)過氧化，保護細胞和細胞器功能的完整性，減少細胞內(nèi)物質(zhì)的丟失，減少酶活性的損失，為機體提供連續(xù)不斷的能量輸出，進而延緩疲勞的發(fā)生，是亞精胺抗疲勞發(fā)生的可能生理機制。

3.4 有氧訓練在亞精胺抗疲勞中的作用分析

研究證明，適量強度的運動訓練對清除體內(nèi)自由基有積極作用，Lovlin等[20]研究發(fā)現(xiàn)以40%強度運動后血漿MDA濃度顯著低于運動前，以70%強度運動后血漿MDA濃度雖有升高但仍然低于安靜時。韓立明等[21]研究發(fā)現(xiàn)70 min游泳運動顯著降低了小鼠腦、心、肝、腎、肌組織中MDA的含量。同時，長期有氧運動可使機體細胞產(chǎn)生適應性改變，這些變化包括能量和物質(zhì)儲備向著有利于機體機能提高的方向發(fā)展。實驗通過對小鼠每天45 min的有氧訓練，增加小鼠骨骼肌亞精胺的儲備，增大亞精胺對機體的調(diào)節(jié)功能。該研究結果顯示，亞精胺低劑量組游泳時間達到了（152.6±30）min，與楊文領等[22]復合中藥制劑抗小鼠疲勞研究結果相比，對照組力竭游泳時間差別不大，而亞精胺低劑量組力竭游泳時間是中藥復合制劑高劑量組的2倍多，優(yōu)于相同實驗條件的研究相關抗疲勞報道的時間，抗疲勞效果十分突出，說明運動訓練對亞精胺抵抗疲勞有倍增效應。因此，為了最大限度的發(fā)揮外源性抗氧化劑的作用效果，采用適當強度的有氧訓練是非常必要的。

4 結 論

以上結果表明，亞精胺具有極強的抗小鼠疲勞的能力，服用亞精胺可減少體內(nèi)自由基的損傷，并具有顯著的劑量依賴效應。因此，提高骨骼肌細胞膜代謝能力和抗損傷能力，維持正常能量輸出、膜電位穩(wěn)定等細胞正常功能，是亞精胺抗疲勞的可能作用機理，但其具體作用途徑，調(diào)節(jié)方式等都還需要進一步研究。該研究認為亞精胺具有成為優(yōu)秀抗疲勞補劑的潛質(zhì)。

總結抗疲勞研究相關文獻，發(fā)現(xiàn)大多研究還停留在單一物質(zhì)的抗疲勞效果分析?？寡趸瘎┑淖饔脩撌恰版準健钡?，各種抗氧化劑通過不同途徑形成鏈式反應而相互影響，而達到整體抗氧化的目的。所以本實驗認為外源性抗氧化劑的補充應考慮抗氧化劑功能的協(xié)同作用，故加強抗氧化劑的作用的機理研究，重視各物質(zhì)之間的相互作用，達到機體疲勞恢復效果的最大化成為將來抗疲勞研究的方向。

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Influence of Spermidine on Free Radical Metabolism in Skeletal Muscle and Its Anti-fatigue Effect in Mice

HE En-peng, TANG Li-li, GUO Yu-jiang
(Laboratory of Sports Science of Human Body, Xinjiang Normal University, ürümqi 830054, China)

Objective: To explore the influence of spermidine (SPD) on the metabolism of free radicals in skeletal muscle and its anti-fatigue effect in mice. Methods: Mice were divided into negative control (normal saline), low-, middle- and high-dose SPD (0.5, 1.0 and 1.5 mmol/(kg·d), respectively) and positive control groups (A merican g inseng o ral liquid, total saponin 30 mg/(kg·d)). The administration period was 6 days per week for 5 weeks. Before each administration, body weight was measured based on which the volume of administration was determined. The mice were subjected to swimming without weight loading for 45 min each day during the administration period. Ten mice were sampled randomly from each group to examine the exhaustive swimming time. The other 10 mice in each group with 30 min swimming with loading were dissected after 30 min recovery to determine the activities of serum creatine kinase (CK) and skeletal muscle glutathione peroxidase (GSH-Px), total-superoxide dismutase (T-SOD) and succinate dehydrogenase (SDH) and skeletal muscle MDA content. Results: Compared with the negative control group, SPD could prolong the exhaustive swimming time of mice (P ＜ 0.05); The activities of GSH-Px, T-SOD and SDH were improved in skeletal muscle (P ＜ 0.05). Furthermore, the content of MDA was reduced (P ＜ 0.05). On the other hand, compared with the positive control group, low- and medium-dose SPD showed a significant difference in anti-fatigue effect (P ＜ 0.05), and high-dose SPD revealed slightly better anti-fatigue effect than American ginseng although no significant difference was observed (P ＞ 0.05). Conclusion: SPD at a dose of 0.5－1.0 mmol/(kg·d) can increase the activity of antioxidant enzymes and reduce the accumulation of free radicals. Meanwhile, SPD can improve the metabolism of skeletal muscle and prevent injuries, and delay the onset of exercise fatigue in mice significantly. Therefore, SPD is an excellent anti-fatigue tonic.

spermidine (SPD); fatigue; glutathione peroxidase (GSH-Px); malondialdehyde (MDA); succinate dehydrogenase (SDH)

R151.2

A

1002-6630（2014）09-0229-05

10.7506/spkx1002-6630-201409045

2013-05-28

國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目（31160218）；新疆師范大學運動人體科學重點實驗室 基金項目（XJNUYD07）

何恩鵬（1983—），男，講師，碩士，主要從事運動健康促進相關研究。E-mail：heenpeng@sina.com