劉 浩，周建偉，張 瑛，尚占環(huán)，米見對(duì)，龍瑞軍＊

（1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，蘭州730000；2.蘭州大學(xué)青藏高原生態(tài)系統(tǒng)管理國(guó)際中心，蘭州730000；3.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州730000）

藏羊（ovis aries）是我國(guó)三大原始綿羊品種之一，是藏族人民在特殊自然環(huán)境下長(zhǎng)期選育而成的主要畜種［1］。青藏高原是全球海拔最高地區(qū)，素有“世界屋脊”之稱［2］，具有年平均氣溫低（－1 ℃至－5℃）、牧草生長(zhǎng)期極短（6月至9月）、牧草生物量季節(jié)變動(dòng)大的特點(diǎn)［3］。藏羊獨(dú)特的生物學(xué)特征和生理學(xué)機(jī)制，恰好適應(yīng)青藏高原嚴(yán)酷的自然環(huán)境和傳統(tǒng)粗放的管理方式［4］。據(jù)張瑛等［5］報(bào)道，與其他綿羊相比，藏羊具有較低的氮素維持需要量的特點(diǎn)，這可能是經(jīng)過長(zhǎng)期進(jìn)化，藏羊與生活在同一環(huán)境的牦牛一樣進(jìn)化出了比其他低海拔反芻家畜更有效地利用飼糧中的氮以保證生存的特殊機(jī)制［6－10］，瘤胃微生物蛋白是反芻動(dòng)物蛋白質(zhì)的主要來源［11－12］，PD 法估測(cè)瘤胃微生物蛋白因其操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確而又非損害性的特點(diǎn)［13－14］，在20世紀(jì)80、90年代受到國(guó)外反芻動(dòng)物學(xué)者的青睞。但PD 法估測(cè)瘤胃微生物蛋白的研究在我國(guó)起步較晚，相關(guān)研究相對(duì)較少［15］，尤其是關(guān)于藏羊尿中嘌呤衍生物排出量的研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過研究燕麥干草不同限飼水平對(duì)藏羊尿中馬尿酸、肌酐、PD 及其各組分排出量響應(yīng)的影響，為估測(cè)藏羊瘤胃微生物蛋白產(chǎn)量及揭示氮代謝機(jī)制提供依據(jù)，為青藏高原藏羊的生產(chǎn)實(shí)踐提供科學(xué)合理的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

燕麥干草限飼及絕食試驗(yàn)在甘肅省天祝藏族自治縣安遠(yuǎn)鎮(zhèn)蘭州大學(xué)青藏高原生態(tài)系統(tǒng)管理國(guó)際中心烏鞘嶺實(shí)驗(yàn)站（北緯37°12.479′，東經(jīng)102°51.695′，海拔3 154m）進(jìn)行，后期樣品分析于2013年2～6月在蘭州大學(xué)青藏高原生態(tài)系統(tǒng)管理國(guó)際中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)概況

選取5頭體重為（45±2）kg的20月齡、健康的去勢(shì)公藏羊作為試驗(yàn)動(dòng)物，為了更好地開展試驗(yàn)以及減少藏羊試驗(yàn)中的應(yīng)激性，保證數(shù)據(jù)可靠性，在試驗(yàn)正式開始前，對(duì)藏羊進(jìn)行為期20d的適應(yīng)期，以便其熟悉生活環(huán)境、飼養(yǎng)人員及其他實(shí)驗(yàn)設(shè)施。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究分為限飼試驗(yàn)和絕食試驗(yàn)兩個(gè)階段。首先開展限飼試驗(yàn)，分成4個(gè)試驗(yàn)期進(jìn)行，每期為21 d，包括預(yù)試期15d和正試期6d。限飼期內(nèi)，試驗(yàn)動(dòng)物每天08∶00和18∶00各飼喂1次，自由飲水。待藏羊體況恢復(fù)后開展絕食試驗(yàn)，共18d，前10d為預(yù)試期，按藏羊維持水平飼喂飼糧600g／d（干物質(zhì)，DM 基礎(chǔ)），正試期8d，第1天飼喂量減至0.6倍維持水平，第2天減至0.3倍維持水平，第3～6d完全絕食，第7～8d分別恢復(fù)至0.3倍維持水平、0.6倍維持水平，絕食期間自由飲水。根據(jù)預(yù)試期確定45kg藏羊自由采食量（VI）為1000g／d，設(shè)置4個(gè)飼喂水平，分別為30%（304.28g，0.3VI組）、50%（505.96g，0.5VI 組）、70%VI（707.64g，0.7VI）、90%VI（912.85g，0.9VI組）。4×4 拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表1）。

1.4 試驗(yàn)飼糧與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)飼糧為單一的燕麥青干草，用鍘草機(jī)處理成長(zhǎng)度1～2cm 以方便飼喂。飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量（風(fēng)干基礎(chǔ)）：干物質(zhì)（dry matter，DM）88.5%；有機(jī)物（organic matter，OM）82.9%；中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）含量53.1%；酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量39.8%；鈣含量0.39%；磷含量0.18%。具體飼料組成和自由采食水平見表2。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experiment design

表2 試驗(yàn)飼糧組成和自由采食水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 2 Composition and daily intake level of the experimental diets（DM basis）

1.5 樣品采集

限飼試驗(yàn)開始后的第16d，即正試期第1d的08∶00（飼喂前）開始采用全收糞尿法，連續(xù)收集5 d，并記錄每天每頭藏羊的排尿量、排糞量，將每天收集的尿樣混勻，按總尿量的10%取樣，用50%的硫酸溶液酸化，使pH＜3.0，以利于固定尿中NH3－N和避免微生物生長(zhǎng)，并在－20 ℃的冰柜中保存，每期試驗(yàn)結(jié)束后，將5d的糞樣制成混合樣。

1.6 樣品分析

藏羊尿液中嘌呤衍生物各組分、肌酐、馬尿酸的排出量采用安捷倫LC1200 型高效液相色譜儀測(cè)定，方法參照李曉鵬等［16］HPLC法測(cè)定。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010版軟件進(jìn)行整理、繪圖；用SPSS17.0 進(jìn)行One－way ANOVA 和雙變量PEARSON 系數(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 嘌呤衍生物及肌酐、馬尿酸排出量及占總PD比重

由表3知，尿中PD 包括尿囊素、尿酸、次黃嘌呤、黃嘌呤。隨著限飼水平降低，尿中PD 各組分、馬尿酸及總PD 排出量線性增加（P＜0.05），尿囊素在總PD 中所占比重也線性增加（P＜0.01），而尿酸、次黃嘌呤＋黃嘌呤在總PD 中所占比重線性減小（P＜0.01）；次黃嘌呤、黃嘌呤單獨(dú)計(jì)算時(shí)數(shù)值較小且不方便，將次黃嘌呤＋黃嘌呤作為一個(gè)指標(biāo)處理，PD 各組分占總PD 的比重分別為尿囊素66.6%～73.8%，次黃嘌呤＋黃嘌呤為13.5%～18.9%，尿酸為11.2%～14.4%，且隨著限飼水平降低，尿囊素占總PD 比重升高，尿酸和次黃嘌呤＋黃嘌呤占總PD 比重均下降；當(dāng)限飼水平超過0.5VI時(shí)，尿囊素比重差異不顯著（P＞0.05），較高限飼水平的三組與0.3VI 組的尿囊素比重差異顯著（P＜0.05）。

表3 燕麥干草不同限飼水平對(duì)尿中PD、肌酐、馬尿酸排出量及PD 比重的影響Table 3 Effect of different restricted feeding levels of oat hay on urinary excretion of PD，creatinine，hippuric acid and percentage of PD

2.2 嘌呤衍生物各組分、總PD、肌酐、馬尿酸之間相關(guān)性分析

由表4可知，嘌呤衍生物各組分與總PD 之間呈極顯著性相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），馬尿酸與尿囊素、總PD 之間呈顯著相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），肌酐與PD各組分、總PD、馬尿酸之間不相關(guān)（P＞0.05）。

表4 嘌呤衍生物各組分、總PD、肌酐、馬尿酸之間相關(guān)性分析Table 4 Correlations among components of PD，total PD，creatinine and hippuric acid

2.3 可消化有機(jī)物采食量（DOMI）與尿中馬尿酸、總PD 排出量的關(guān)系

由圖1、圖2可知，總PD 排出量（mmol／d）與可消化有機(jī)物采食量（DOMI，kg／d）線性相關(guān)（P＜0.05），其關(guān)系式為：總PD（mmol／d）＝14.066DOMI（kg／d）＋1.5262，（n＝20，R2＝0.9883）；馬尿酸排出量（g／d）與可消化有機(jī)物采食量（DOMI，kg／d），其關(guān)系式為：馬尿酸排出量（g／d）＝19.365DO－MI（kg／d）＋3.6437（n＝20，R2＝0.9666）。

2.4 絕食期內(nèi)源嘌呤衍生物動(dòng)態(tài)變化

由圖3 可知，隨著絕食時(shí)間的延長(zhǎng)，尿中尿囊素、尿酸、次黃嘌呤＋黃嘌呤以及總PD 排出量均呈現(xiàn)先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，尿囊素動(dòng)態(tài)變化與總PD 基本一致，絕食后第4～6d嘌呤衍生物排出量基本達(dá)到穩(wěn)定水平且在第5d時(shí)排出量最低，據(jù)此可以計(jì)算出內(nèi)源PD的每天排出量為1.95mmol／d。

圖1 可消化有機(jī)物采食量與總PD 排出量關(guān)系Fig.1 The relationship between DOMI and excretion of total PD

圖2 可消化有機(jī)物采食量與馬尿酸排出量關(guān)系Fig.2 The relationship between DOMI and excretion of hippuric acid

圖3 藏羊絕食期尿液PD 排出量Fig.3 Urinary PD excretion during the fasting period in Tibetan sheep

3 討論

尿囊素是哺乳動(dòng)物嘌呤代謝的終產(chǎn)物［17］。對(duì)反芻動(dòng)物而言，尿中嘌呤衍生物來源于被宿主吸收的瘤胃微生物蛋白［18－19］及自身組織蛋白的嘌呤代謝，而后者所占的比重很?。?1］。因此，Topps和Elliott推斷［20］反芻動(dòng)物尿中尿囊素的排出量與其瘤胃微生物之間具有某種關(guān)系，該假設(shè)后來在黃牛［21］、水牛［22］、牦牛［7，9］、綿羊［23］、山羊［24］上被證實(shí)并建立了有機(jī)物采食量與尿中嘌呤衍生物排出量的相關(guān)模型。

3.1 燕麥干草不同飼喂水平對(duì)藏羊尿中PD、肌酐、馬尿酸排量的影響

3.1.1 嘌呤衍生物 本試驗(yàn)中，尿中PD 及各組分排出量隨著限飼水平降低而增加，這與王永新等［25］和徐萍等［26］得出的結(jié)論一致。尿中PD 各組分排出量對(duì)各限飼水平的響應(yīng)表明，尿中PD（主要為尿囊素）排出量對(duì)采食量非常敏感；當(dāng)采食水平大于0.5VI時(shí)，藏羊尿中尿酸排出量相對(duì)穩(wěn)定；而尿中黃嘌呤＋次黃嘌呤排出量對(duì)采食量的敏感性介于前兩者之間。與Chen等［11］在綿羊上的結(jié)果相似，隨著限飼水平的降低，尿中尿囊素在總PD 中的比重增加，而尿酸、黃嘌呤＋次黃嘌呤的降低。當(dāng)飼喂水平大于0.3VI 時(shí)，尿中尿囊素比重相對(duì)穩(wěn)定，在71.38%～73.82%之間；當(dāng)飼喂水平大于0.3VI時(shí)，尿中黃嘌呤＋次黃嘌呤比重相對(duì)穩(wěn)定，在13.5%～15.02%之間；當(dāng)飼喂水平小于0.9VI時(shí)，尿中尿酸比重相對(duì)穩(wěn)定，在12.80%～14.39%之間。反芻動(dòng)物尿中PD 的主要成分是尿囊素，其次為尿酸，最后是黃嘌呤＋次黃嘌呤［27－28］，本試驗(yàn)藏羊尿中PD尿囊素含量低于黃牛［21］、牦牛［7，9］、及綿羊［29］上的研究結(jié)果，但Chen等［30］在綿羊中得出的結(jié)果相近。據(jù)報(bào)道，黃牛尿液PD 中黃嘌呤＋次黃嘌呤含量相對(duì)較低，基本可以忽略不計(jì)［28］，Chen等［30］測(cè)得綿羊尿液PD 中黃嘌呤＋次黃嘌呤含量在10.15%～15.00%之間，略低于本試驗(yàn)研究結(jié)果。因此，藏羊尿液PD 中相對(duì)較高的黃嘌呤＋次黃嘌呤含量和相對(duì)較低的尿囊素含量，可能是由于其體內(nèi)血液、肝臟和腸道粘膜細(xì)胞中較低黃嘌呤氧化酶活性，致使藏羊體內(nèi)次黃嘌呤、黃嘌呤沒有完全轉(zhuǎn)化成尿囊素。

3.1.2 肌酐 肌酐是肌酸和磷酸肌酸代謝的終產(chǎn)物，它主要由肌肉中磷酸肌酸的非酶促反應(yīng)生成，再釋放到血液中，隨尿排泄。反芻動(dòng)物尿中肌酐排出量與體重［31］、肌肉含量［32］、品種及生理期［9］等因素有關(guān)，而不受飼糧的影響，即使在代謝體重基礎(chǔ)上，體重較大的動(dòng)物尿中排出肌酐多［33］。本試驗(yàn)同樣表明尿中肌酐排出量不受日糧的影響，因此肌酐通常作為一種穩(wěn)定的內(nèi)標(biāo)物來測(cè)定腎小球率過濾，Chen等［34］報(bào)道綿羊尿中肌酐排出量的均值為0.46 mmol／（kg BW0.75·d），Hovell等［35］報(bào)道綿羊尿中肌酐排出量為0.43～0.47mmol／（kg BW0.75·d），楊膺白等［36］在對(duì)波爾山羊研究時(shí)測(cè)出肌酐量為0.46～0.48mmol／（kg BW0.75·d），本試驗(yàn)中藏羊在不同限飼水平下尿中肌酐排出量的范圍為0.40～0.42mmol／（kg BW0.75·d），與上述結(jié)果相近。

3.1.3 馬尿酸 馬尿酸是苯甲酸和甘氨酸在肝臟中結(jié)合的產(chǎn)物，對(duì)防治草食動(dòng)物苯甲酸中毒具有重要意義［37］。本研究中，隨著限飼水平升降低，藏羊尿中馬尿酸排出量線性增加，表明馬尿酸排出量與飼糧攝入量有關(guān)，目前對(duì)于馬尿酸的研究及應(yīng)用較少，僅在牛奶受尿液污染方面有過報(bào)道［38］。

3.2 嘌呤衍生物各組分、總PD、肌酐、馬尿酸的相關(guān)性研究

反芻動(dòng)物體內(nèi)的核酸和嘌呤底物在核苷磷酸化酶的作用下降解為黃嘌呤和次黃嘌呤，再被黃嘌呤氧化酶降解為尿酸，然后進(jìn)一步降解為尿囊素［11］，由此可見，尿中PD 及各組分之間可能存在某種相關(guān)關(guān)系，本試驗(yàn)中尿囊素、尿酸、次黃嘌呤＋黃嘌呤、總PD 四個(gè)指標(biāo)兩兩之間存在正相關(guān)關(guān)系也恰好驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。馬尿酸和尿中PD 及尿囊素呈正相關(guān)，因此，通過建立某種模型，只要測(cè)得其中一個(gè)指標(biāo)即可以推測(cè)另外兩個(gè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)，使工作量大大減小。尿中馬尿酸、PD 及其組分均受日糧水平的影響，而尿中肌酐不受日糧影響，因此，肌酐與馬尿酸、PD 及其組分不相關(guān)。

3.3 可消化有機(jī)物采食量（DOMI）與總PD、馬尿酸排出量的關(guān)系

采食量是影響動(dòng)物尿中PD，馬尿酸排出量的重。尿中PD 排出量隨DOMI 的增加而線性增加［7，9，39］，本試驗(yàn)中，總PD 排出量（mmol／d）與可消化有機(jī)物采食量（DOMI，kg／d）的關(guān)系式為：總PD（mmol／d）＝14.066DOMI（kg／d）＋1.5262，（n＝20，R2＝0.9883）。當(dāng)DOMI＝0 時(shí)，PD＝1.53 mmol／d［即0.09mmol／（kg BW0.75·d）］，該值可用于內(nèi)源嘌呤衍生物排出量的估測(cè)；馬尿酸排出量與DOMI具有很好的相關(guān)性，其關(guān)系式為馬尿酸排出量（g／d）＝19.365DOMI＋3.6437（n＝20，R2＝0.9592），其在測(cè)定采食量及預(yù)測(cè)尿中PD 排出量等方面都有潛在的應(yīng)用價(jià)值，有待深入研究。

3.4 絕食期藏羊內(nèi)源PD

本試驗(yàn)測(cè)得藏羊內(nèi)源PD 排出量為1.95 mmol／d［即0.11mmol／（kg BW0.75·d）］，與通過尿中PD 和DOMI所建立模型估測(cè)值接近。據(jù)Chen等［30］報(bào)道綿羊平均每天排出內(nèi)源PD 為0.15 mmol／（kg BW0.75·d），Lindberg［40］報(bào)道山羊內(nèi)源PD 排出量為0.19mmol／（kg BW0.75·d），Soejono等［41］報(bào)道黃牛每天排出內(nèi)源PD 為0.13～0.14 mmol／（kg BW0.75·d），而藏羊內(nèi)源PD 排出量均低于上述所選動(dòng)物，可能是藏羊與生活在同一生境的牦牛一樣，進(jìn)化出了特殊的腎臟調(diào)控機(jī)制［42］，以適應(yīng)青藏高原牧草長(zhǎng)期匱乏的現(xiàn)狀。

4 結(jié)論

限飼水平與馬尿酸、PD 及各組分排出量呈負(fù)相關(guān)，但與肌酐排出量無相關(guān)性；利用PD 與DOMI建立的模型估測(cè)出內(nèi)源PD 排出量與內(nèi)源PD 實(shí)際排出量接近，驗(yàn)證了模型的準(zhǔn)確性。

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