劉剛強， 劉 毅

綜 述

脂肪間充質(zhì)干細胞在脂肪組織工程中的研究現(xiàn)狀

劉剛強， 劉 毅

脂肪移植; 脂肪組織工程; 脂肪間充質(zhì)干細胞; 支架

脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived stem cells， ADSCs)是由PA Zuk等在2002年首先從脂肪組織中分離出的一種成纖維細胞樣細胞，形態(tài)與骨髓間充質(zhì)干細胞相似，可以向軟骨細胞、成骨細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞和脂肪細胞等不同胚層來源的細胞分化，具有自我更新能力和多向分化潛能[1]。因其具有來源充足、取材方便、無倫理爭議的優(yōu)勢，近年來,作為脂肪組織工程的種子細胞受到研究者的廣泛關注。筆者以ADSCs為種子細胞構建組織工程脂肪的研究進展作一綜述。

1 ADSCs

ADSCs的分離多采用膠原酶消化離心的方法。供體的年齡、BMI、脂肪類型、取材部位、手術類型、培養(yǎng)條件、種植密度及培養(yǎng)基成分等因素對ADSCs的增殖與分化均有一定的影響[2]。Wu等[3]發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加，ADSCs的成脂分化能力略有所下降，但足以滿足我們研究的需要。Russo等[4]比較不同取材部位ADSCs的活力、單克隆能力、倍增時間及成脂、成骨誘導能力，發(fā)現(xiàn)皮下及心包的脂肪分離的ADSCs能被更好的成脂誘導，而網(wǎng)膜脂肪分離的ADSCs能被更好的成骨誘導。胸部與腹部脂肪比較發(fā)現(xiàn)，胸部脂肪分離的ADSCs對成纖維細胞生長因子-2表達明顯高于腹部，而成纖維細胞生長因子-2是血管生成的重要因子[5]。缺氧條件對血管化工程脂肪的構建也有明顯的促進作用[6]。

1.1 ADSCs的生物學特性 ADSCs在倒置顯微鏡下可見為大而扁平的單層分布，細胞呈長梭形、星形、成纖維細胞形及不規(guī)則形。ADSCs在不同的條件下被成功誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、肝臟細胞等中胚層細胞，同時還具有向其他胚層細胞分化的能力[7]。目前，ADSCs達成共識的陽性表面分子包括：CD9，CD10，CD13，CD29，CD44，CD49e，CD51，CD55，CD59，CD90，CD166。陰性表達的表面分子包括：CD11a、b、c，CD14，CD16，CD18，CD31，CD45，CD50，CD56，CD104，HLA-DR。未達成共識的表面分子有CD34，CD49b，CD49d，CD54，CD61，CD62e，CD63，CD71，CD73，CD105，CD106，CD140a，CD146[8]。

1.2 ADSCs作為脂肪組織工程種子細胞的優(yōu)越性 JM Gimble在2003年提出干細胞應用于臨床必須遵守足夠的細胞、最小的創(chuàng)傷、能通過常規(guī)可重復的方式向多系細胞分化、安全有效地自體移植或異體移植和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)原則。ADSCs含量豐富，1 g脂肪能得到約1.0×106的ADSCs，在任何批號胎牛血清的DMEM中都能很好的增殖[9]；ADSCs與骨髓間充質(zhì)干細胞具有相似的生物特性及多系分化能力，且較骨髓間充質(zhì)干細胞不易受到腫瘤細胞的污染，更易進行體外凈化[10]；ADSCs具有低免疫原性和免疫抑制作用，使其能夠逃脫機體的免疫監(jiān)視，有助于抑制異體移植的免疫排斥反應。研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs的主要組織相容性復合物Ⅰ所產(chǎn)生的細胞因子，對脾細胞的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用[11]。

1.3 ADSCs的成脂誘導分化 脂肪分化多認為經(jīng)歷多能干細胞-脂肪母細胞-前脂肪細胞-不成熟脂肪細胞-成熟脂肪細胞的過程。取生長良好的第4代細胞，用0.25%胰酶(含1 mmolEDTA)消化后，以2×107/L的濃度接種于預置多聚賴氨酸預處理蓋玻片的6孔板內(nèi)。細胞達80%以上融合時，加入成脂誘導液(含1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L胰島素、100 mg/L吲哚美辛和體積分數(shù)10%胎牛血清)，3 d后換成脂維持液(含10 mg/L胰島素的完全培養(yǎng)基)，24 h再換成脂誘導液，誘導2周后進行油紅O染色鑒定誘導情況[12]?？梢园l(fā)現(xiàn),ADSCs內(nèi)有脂滴形成，并逐漸增多融合，誘導2周脂滴體積能占細胞體積的90%以上，將細胞核擠至一邊，這種形態(tài)與成熟脂肪細胞非常相似，說明ADSCs已經(jīng)分化為脂肪細胞。研究表明，胰島素具有加強成脂轉(zhuǎn)化因子表達的作用[13]。

1.4 ADSCs成脂分化的分子調(diào)控 成脂分化是一個復雜的過程，成脂轉(zhuǎn)化因子包括PPARγ，SREBP-1c，C/EBPs。PPAR即過氧化物酶體增殖物活化受體，PPAR及PGC1基因家族有PPARA，PPARG，PPARD，PPARGC1A和PPARGC1B[14]。PPARγ是一種與脂肪細胞分化、脂類存儲相關的核激素受體，在成脂分化過程中起關鍵作用，刺激增加各種相關基因的表達，而使ADSCs分泌因子(如腫瘤壞死因子，瘦素等)減少，脂聯(lián)素的含量增加。PPARγ有3種亞型PPARγ1、PPARγ2及PPARγ3，γ1型可在不同組織細胞中低水平表達，γ2型存在于脂肪細胞中，γ3型僅在巨噬細胞和大腸中被發(fā)現(xiàn)。噻唑烷二酮類抗糖尿病治療藥物為外源性高親和力配體。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)是最先從小鼠的脂肪細胞里克隆出的一種轉(zhuǎn)錄因子，其脂肪生成酶的基因表達，對于脂質(zhì)穩(wěn)定性有很重要的作用，但目前SREBP的脂肪形成機制及與PPARγ的關系尚不明確。C/EBPs是CCTTA增強子結(jié)合蛋白，屬DNA結(jié)合區(qū)b-zip家族中的一種，分子中有一個亮氨酸拉鏈樣結(jié)構的二聚體。在脂肪細胞及誘導成脂的細胞早期高表達C/EBPs的亞結(jié)構，前脂肪細胞轉(zhuǎn)變成脂肪細胞的過程中C/EBPs有很重要的作用，但在成熟的脂肪細胞中C/EBPs含量較少[15]。在PPARγ的基因啟動區(qū)可能包含有C/EBPs的位點，隨著PPARγ基因啟動，C/EBPs也伴隨著表達。PPARγ與C/EBPs聯(lián)合對ADSCs的成脂分化有很強的促進作用[16]。相反，脂肪結(jié)合蛋白4(FABP4)是一種存在于胞質(zhì)的脂肪酸分子伴侶，對PPARγ的表達及成脂分化有抑制作用[17]。

2 ADSCs與支架材料

構建脂肪組織工程理想的支架材料應具備良好的機械性能、生物降解性、生物相容性、低免疫原性、促血管化性等特點。用于構建脂肪組織工程的支架材料主要分為天然材料和人工合成材料，目前常用的主要支架材料有膠原蛋白、透明質(zhì)酸、絲素蛋白、殼聚糖、藻朊酸鹽、PLGA、富含血小板血漿、脫細胞基質(zhì)等[18]。為探索出更加適宜的脂肪組織工程支架，近年來研究人員進行了多方面的嘗試。迄今為止，人們發(fā)現(xiàn)的膠原蛋白有19種，從動物的皮膚或跟腱中提取的Ⅰ型膠原蛋白在脂肪組織工程中運用較多，對于細胞黏附、誘導分化有很好的促進作用，其生物相容性好，降解速度可調(diào)，是一類良好的可引導組織再生的生物材料，Itoi等[19]以Ⅰ型膠原海綿、非紡PLGA和透明質(zhì)酸凝膠為支架進行對比實驗研究，結(jié)果表明，在這3種支架中,Ⅰ型膠原海綿更適合作ADSCs構建脂肪組織工程的支架。Rose等[20]對膠原蛋白聯(lián)合殼聚糖并加入0.2%蘆薈汁所構成的支架材料的研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白支架加入蘆薈汁組細胞增殖能力強于單純膠原蛋白-殼聚糖支架組，更明顯強于單純細胞培養(yǎng)增殖。Girandon等[21]將ADSCs種植于不同的3D天然支架材料，比較藻酸鹽、纖維蛋白凝膠和膠原海綿等支架所構建的工程脂肪，發(fā)現(xiàn)纖維蛋白凝膠組產(chǎn)生的新組織在機械性能、脂化程度、細胞活性及VEGF表達方面均高于其他各組。

透明質(zhì)酸是一種糖胺聚糖，廣泛分布在動物和人體組織及細胞外基質(zhì)中，有很多親水集團，具有很強保存水分的能力。近年來,透明質(zhì)酸在脂肪組織工程中的應用研究取得重要進展[22]。其作為生物支架復合ADSCs可加速軟組織血管化的形成[23]。透明質(zhì)酸及殼聚糖也常與其他材料聯(lián)合作為脂肪組織工程的支架材料[24]。絲素蛋白是一種天然的高分子聚合物，其低免疫原性，良好的生物相容性，緩慢的降解速度及穩(wěn)定的機械性能等特性使其成為一種新型的生物支架材料[25]。近年來,通過制備方法的改進，表面分子修飾等技術對絲素蛋白性能的改變，絲素蛋白支架都被廣泛運用于各組織工程領域，包括骨、血管、神經(jīng)、軟骨、韌帶、肌腱、心臟、眼和膀胱組織工程等[26]。藻朊酸是一種天然生物材料，已被普遍用作組織工程支架材料，其可塑性好，具有突出的生物相容性和低免疫排斥反應等特點。藻朊酸常作為用于構建三維的組織工程脂肪的支架材料[27]。聚乳酸-聚羥基乙酸共聚體、聚乳酸和聚羥基乙酸同屬于人工合成的聚合物，已獲得美國FDA批準，被廣泛用于組織工程領域的研究。聚乳酸-聚羥基乙酸共聚體被制作成直徑為100～250 μm的微球支架，與干細胞聯(lián)合后可直接注射在移植部位，對受體所造成的傷害很小，具有廣闊的應用前景[28]。水溶性聚乳酸-聚羥基乙酸共聚體與殼聚糖交聯(lián)的多孔支架運用于脂肪組織工程取得較好的效果[29]。其他人工合成的聚合物還有：聚己內(nèi)酰胺、聚乙烯乙二、聚氨基甲酸乙酯等[30]。富含血小板血漿可來源于自體的血小板濃縮，其最大特點是含有大量的血小板、多種高濃度生長因子及豐富的纖維蛋白，因其制備簡便、價格低廉和無免疫原性的特點，常被用于脂肪組織工程的支架材料中[31]。富含血小板血漿能作為自體材料應用于脂肪組織工程，可促進ADSCs增殖和成脂分化[32]。脫細胞基質(zhì)支架是由細胞外基質(zhì)構成的生物支架，近年來廣泛應用于脂肪組織工程[33]，脫細胞基質(zhì)可以從脂肪組織或大網(wǎng)膜通過一系列的物理、化學及酶促反應獲得，細胞的移除并沒有明顯的影響脫細胞基質(zhì)的形態(tài)和結(jié)構，脫細胞基質(zhì)含有膠原蛋白、彈性蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白和黏多糖等多種生物活性分子，具有促進細胞聚集、調(diào)節(jié)細胞活動以及防護支持作用，且無明顯的免疫反應，脫細胞基質(zhì)還具有良好的機械性能，可以制作出不同3D形狀的脂肪組織工程支架[34]。細胞外基質(zhì)可以與脂肪間充質(zhì)干細胞膜受體相互作用，促進成脂誘導[35]。脫細胞脂肪內(nèi)有交叉排列的甲基丙烯酸乙二醇殼聚糖或甲基丙烯酸硫酸軟骨素，結(jié)構穩(wěn)定，濕度為5%的脫細胞脂肪聯(lián)合水凝膠支架對脂肪形成有明顯的促進作用[36]。

3 ADSCs與生物分子

脂肪組織工程的構建除種子細胞和支架材料外，細胞生長的微環(huán)境也對成功構建工程脂肪有重要的作用。多種蛋白分子可以促進ADSCs增殖，如堿性成纖維生長因子2、血小板生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子1?？寡趸瘎┖偷外}培養(yǎng)基也能提升ADSCs的生長速度和活力。組織工程脂肪移植入活體內(nèi)早期不能很好地建立血液供應系統(tǒng)，大量脂肪堆集在一起，會因供血不足導致脂肪細胞溶解、吸收、壞死，且易引發(fā)感染、血腫、硬結(jié)、囊腫、壞死等并發(fā)癥發(fā)生，多種促血管生長因子被用于脂肪組織工程的構建，如內(nèi)皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、動力增益因子、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等；內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維生長因子不僅可以促進ADSCs增殖能力，對ADSCs成脂分化有一定的促進作用[37]。血管內(nèi)皮生長因子165和堿性成纖維細胞生長因子的暫時過度表達可建立有效的血管網(wǎng)，從而促進組織工程脂肪的存活[38]。肝細胞生長因子在促進工程脂肪血管化方面也有明顯的效果[39]。另外，內(nèi)皮生長因子對ADSCs分泌促血管化激素有很強的刺激作用，這種刺激作用主要通過細胞外調(diào)節(jié)激酶和氨基端激酶途徑實現(xiàn)[40]。ADSCs也可通過旁分泌作用分泌出多種生長因子促進自身及周圍細胞的增殖[41]，也可分泌多種細胞因子，如FLT-3受體，粒細胞集落刺激因子，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，巨噬細胞集落刺激因子，白細胞介素6、7、8、11，腫瘤壞死[42]。在缺氧條件下，這些因子的表達明顯增加[43]。ADSCs注入體內(nèi)后分布示蹤的研究中發(fā)現(xiàn)，在缺血組織及周圍分布增多，8周后可有微血管形成[44]，說明ADSCs本身亦有促進血管形成的作用。

4 存在的問題與展望

目前，ADSCs構建工程脂肪的方法可歸納為4類：①利用支架材料引導組織再生構建工程脂肪，即將ADSCs種植在可吸收的支架上，再植入體內(nèi)，細胞分化的同時支架材料降解吸收，從而形成所需的脂肪組織；②可注射的復合材料構建工程脂肪技術；③利用富含血管的大網(wǎng)膜組織或脂肪基質(zhì)支架構建的脂肪組織工程，以便利用固有的血管建立血管化脂肪組織；④攜帶生長因子促進脂肪組織再生及微血管建立的脂肪工程技術。組織工程化脂肪應用于臨床治療主要有兩種方案：一種為體外將種子細胞接種于支架上進行成脂誘導，然后再移植于體內(nèi)；另一種將種子細胞與生物材料復合物直接移植到體內(nèi)，再進行體內(nèi)誘導成脂分化。對于ADSCs的研究目前雖然取得了很大的成就，但真正應用于臨床還有很多問題尚未解決，如何在體內(nèi)、外控制增殖分化的進程？控制進程的因子有哪些？雖說ADSCs較安全，但ADSCs長期致病性的問題，能否找到一種ADSCs特征性標志分子，以便在實驗中分離與鑒定ADSCs，控制ADSCs的純度與移植數(shù)量？ADSCs增殖與分化、細胞間相互作用的分子機制仍不清[45]。脂肪組織提取細胞前的準備、ADSCs擴增與維持的技術、所需細胞的純度、ADSCs數(shù)量的測定、體外多向分化潛能的檢測等尚無統(tǒng)一標準。盡管存在以上問題，但ADSCs仍然是目前構建組織工程脂肪最適宜的種子細胞，隨著對ADSCs認識的不斷深入及支架材料不斷改進，相信脂肪組織工程終將會成為解決大面積軟組織缺損的重要方法。

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730050 甘肅 蘭州，蘭州大學第二臨床醫(yī)學院(劉剛強)；蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院 全軍燒傷整形外科中心(劉 毅)

劉剛強(1985-)，男，甘肅天水人，碩士研究生.

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.11.015

2014-09-12)