劉剛強(qiáng), 劉 毅

綜 述

共培養(yǎng)體系在血管化組織工程脂肪中的應(yīng)用進(jìn)展

劉剛強(qiáng), 劉 毅

脂肪來源干細(xì)胞； 組織工程； 種子細(xì)胞

脂肪組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為廣大的軟組織缺損患者帶來了希望。目前雖已取得了很大的成績，但仍存在諸多不足，面臨著移植物再吸收、纖維組織替代、油脂囊腫形成等一系列問題[1]。如何有效地保證移植工程脂肪長期存活，并保持其旺盛增殖狀態(tài)以及維持脂肪細(xì)胞特性，是脂肪組織移植成功的關(guān)鍵。任何組織的存活都離不開營養(yǎng)支持，脂肪組織也不例外。淺層脂肪細(xì)胞尚可通過血液彌散作用攝取一定營養(yǎng)，而這種彌散范圍是相當(dāng)有限的；深部的脂肪細(xì)胞只有通過血管來保持有效的物質(zhì)交換，血管形成在脂肪組織工程中起著相當(dāng)重要的作用[2]。如何建立血管化工程脂肪成為近年來人們研究的熱點(diǎn)問題[3]。脂肪組織工程中的共培養(yǎng)策略，主要是將種子細(xì)胞與內(nèi)皮或內(nèi)皮祖細(xì)胞共同培養(yǎng)，以在工程脂肪中建立良好的血供為目的，為解決移植脂肪細(xì)胞在體內(nèi)難以長期存活的難題，提供了一條新的思路。共培養(yǎng)體系不僅運(yùn)用于骨組織工程、血管組織工程、肌肉組織工程等領(lǐng)域，近年來在脂肪組織工程中也得到了廣泛的運(yùn)用。筆者從血管化脂肪組織工程共培養(yǎng)體系的細(xì)胞來源、作用機(jī)制、支架材料及培養(yǎng)條件等方面作一綜述。

正常成年人脂肪組織由脂肪細(xì)胞及其周圍基質(zhì)成分構(gòu)成，其中有50%的細(xì)胞成分為脂肪細(xì)胞，體積約96%，余為血管、神經(jīng)及結(jié)締組織，體積占4%。脂肪組織中有豐富的血管供給，血液供給與毛細(xì)血管的密度是骨骼肌中的2～3倍。每個脂肪細(xì)胞至少都與一根毛細(xì)血管相接觸。在脂肪組織中，脂肪細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，還可共同調(diào)節(jié)脂肪組織的生長情況。因此，在脂肪組織工程中，建立與內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)體系對脂肪組織工程具有重要的意義。

1 脂肪組織工程中共培養(yǎng)體系的細(xì)胞來源

目前，脂肪組織工程種子細(xì)胞主要為成體干細(xì)胞，迄今為止，運(yùn)用最多的為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)、脂肪來源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)、臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(mesnchymal stem cells, cbMSCs)。內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, ECs)與內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)為共培養(yǎng)體系常用于構(gòu)建血管化工程脂肪的細(xì)胞。

BMSCs具有充足的來源，較強(qiáng)的分化與增殖能力及良好的可塑性，一直以來是脂肪組織工程主要的種子細(xì)胞來源，但其有在骨髓中含量較低，不易獲取且容易引起供區(qū)并發(fā)癥等缺點(diǎn)[4]。ADSCs具有來源充足，容易獲取，患者痛苦小，且可以自身取材，克服異體免疫排斥反應(yīng)，不易引起供區(qū)并發(fā)癥等優(yōu)點(diǎn)，成為脂肪組織工程的理想種子細(xì)胞[5]。近年來，有較多將其用于血管化工程脂肪構(gòu)建共培養(yǎng)體系的報道[6]。

ECs是血管內(nèi)壁的單層細(xì)胞，可以分泌多種血管活性物質(zhì)，在血管構(gòu)建方面有重要作用[7]。ECs是目前最常用于共培養(yǎng)體系構(gòu)建血管化工程脂肪的細(xì)胞，通過內(nèi)皮細(xì)胞與種子細(xì)胞間相互作用，可促進(jìn)移植物血管形成與血管新生。根據(jù)來源不同，可以分為大血管內(nèi)皮細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)為最常見的大血管內(nèi)皮細(xì)胞，也可來源于大隱靜脈、主動脈等血管內(nèi)壁。微血管內(nèi)皮細(xì)胞可以在脂肪及肺等組織中獲得。由于具有新生兒臍帶容易獲得，來源充足，取材方便等優(yōu)點(diǎn)，HUVEC成為共培養(yǎng)體系中最常用的細(xì)胞來源之一[8]。EPCs為血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，能分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，可以從臍血、脂肪及骨髓中分離提取。由于具有較好的成血管能力和生物活性，近年來，在構(gòu)建共培養(yǎng)體系中得到較多應(yīng)用[9]。但由于內(nèi)皮祖細(xì)胞存在數(shù)量較少，提取困難，不易純化，缺乏特異標(biāo)志分子而鑒別困難等缺點(diǎn)，限制了其在臨床上的應(yīng)用[10]。

2 共培養(yǎng)體系促血管化工程脂肪的作用機(jī)制

構(gòu)建血管化工程脂肪是脂肪組織工程中共培養(yǎng)策略的主要目的，無論在體內(nèi)還是體外實(shí)驗中，工程脂肪的長期存活必須依賴血管提供營養(yǎng)，尤其對于大而深彌散無法達(dá)到的組織而言，更需要血液的供給[11]。由于很多組織都是富含血管組織，因此，建立有效的血管網(wǎng)絡(luò)，并使宿主的血液可以灌注到構(gòu)建的組織中來，是當(dāng)前組織工程領(lǐng)域一個重要的課題。

共培養(yǎng)體系中，每2種細(xì)胞之間的作用方式有以下2種：①直接接觸作用。兩種細(xì)胞通過直接接觸，促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生一定的生物學(xué)效應(yīng)。②間接接觸作用，即旁分泌作用。一種細(xì)胞釋放一種特定的物質(zhì)，與另一種細(xì)胞表面的受體結(jié)合，促進(jìn)其產(chǎn)生一定的生物性效應(yīng)[12]。ECs三維培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，其具有聚集并成管狀結(jié)構(gòu)的特性，但在支架上長期單獨(dú)培養(yǎng)，卻很難保持其持久的增殖性。然而，在干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)中，內(nèi)皮細(xì)胞可以刺激干細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)釋放，進(jìn)一步刺激內(nèi)皮細(xì)胞，使其可以聚集并形成微血管結(jié)構(gòu)[13]。促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞成微血管的主要因子除了以上兩種外，還有：堿性纖維生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、內(nèi)皮生長因子(endothelial growth factor, EGF)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1, IGF-1)等[14]。Strassburg等[15]通過研究比較ADSCs對HUVEC及EPCs成血管的作用發(fā)現(xiàn)，ADSCs主要增強(qiáng)了內(nèi)皮祖細(xì)胞的成血管能力，而對HUVEC作用較弱。但Sandra在CAM模型上進(jìn)行血管化工程脂肪研究中發(fā)現(xiàn)，HUVEC組卻比EPCs組形成更豐富的血管網(wǎng)絡(luò)[12]。在成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，與ECs接觸不僅可以刺激成纖維細(xì)胞釋放VEGF，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFⅡ型受體，還可激活內(nèi)皮細(xì)胞的氮氧合酶，釋放血管活性物質(zhì)一氧化氮[16]。Jennifer將ADSCs與HUVEC在絲素蛋白上三維培養(yǎng)，通過對甘油三酯、成脂基因及基礎(chǔ)脂解分析發(fā)現(xiàn)，HUVEC對ADSCs的成脂功能具有促進(jìn)作用[17]。另外，共培養(yǎng)體系也可調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化與再生。在工程脂肪構(gòu)建策略中，種子細(xì)胞一部分既要分化為成熟脂肪細(xì)胞，一部分又要保持干細(xì)胞的特性。保持其強(qiáng)烈增殖與多分化的能力，傳統(tǒng)上可以使用滋養(yǎng)細(xì)胞釋放出一些生長因子、細(xì)胞因子及營養(yǎng)素等，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間的信號聯(lián)系，保持干細(xì)胞存活并增殖。共培養(yǎng)體系也被用于保持種子細(xì)胞“干性”。

3 脂肪組織工程中共培養(yǎng)體系的支架材料

共培養(yǎng)體系中除了細(xì)胞間相互作用外，細(xì)胞與支架材料也將起著相當(dāng)重要的作用，并可對細(xì)胞間作用產(chǎn)生一定的影響；通過對支架材料的改性，可以改變一種細(xì)胞的表型，進(jìn)而影響到另一種細(xì)胞的功能。這些可以改變的支架材料特性包括：表面化學(xué)修飾、表面形態(tài)、空間模式、孔隙率、可濕性、帶電性及機(jī)械性能等[18]，可根據(jù)實(shí)驗的目的和涉及的細(xì)胞類型來選擇材料的不同特性[19]。聚丙烯酰胺(polyacrylamide, PAM)修飾的支架材料有利于與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系的構(gòu)建，微孔系統(tǒng)對干細(xì)胞的分化有促進(jìn)作用[20]。支架材料的孔隙率與細(xì)胞的遷移擴(kuò)散相關(guān)聯(lián)[21]，對于構(gòu)建血管化工程脂肪有重要的意義。Yao等將ADSCs種植于膠原蛋白/藻朊酸鹽微球，再與HUVEC共培養(yǎng)，注射在大鼠頭部，成功構(gòu)建出了血管化工程脂肪[22]。

雞胚絨毛尿囊膜(chorioallantoic membrane, CAM)是雞胚胎發(fā)育過程中，位于胚胎外富含血管的膜性結(jié)構(gòu)，具有低免疫原性，常被用于血管化組織工程的研究中。通過分析是皮細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)能夠促進(jìn)CAM中血管長入細(xì)胞團(tuán)中(血管形成)，內(nèi)皮細(xì)胞形成的管狀結(jié)構(gòu)能否與宿主血管建立有效的連接(血管新生)，表明CAM是血管化研究中比較穩(wěn)定的模型[12]。

纖維連接素(fibronectin, FN)既可以促進(jìn)細(xì)胞的粘連與生長，也可提高細(xì)胞的融合率，有效縮短融合周期。Strassburg等[12]以纖維連接素作為共培養(yǎng)體系的細(xì)胞外基質(zhì)，成功構(gòu)建出血管化豐富的工程脂肪。

甲基纖維素(methyl cellulose, MC)凝膠微球被用來作為共培養(yǎng)體系研究的支架材料。Chen等[23]將HUVEC與cbMSCs種植，與MC凝膠微球材料共培養(yǎng)，注入后肢缺血的大鼠模型體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)新生血管可以提供缺血組織血供，明顯改善組織缺血壞死。

此外，傳統(tǒng)的脂肪組織工程支架材料，如膠原蛋白、絲素蛋白及PLG等材料，也常被運(yùn)用在血管化脂肪組織工程共培養(yǎng)體系中。

4 共培養(yǎng)體系的條件與比例

在單種細(xì)胞培養(yǎng)中，不同的細(xì)胞擁有不同的培養(yǎng)基，然而在共培養(yǎng)體系中，如何使用一種培養(yǎng)基而使兩種細(xì)胞都能保持正常增殖狀態(tài)與特性，目前尚無統(tǒng)一的定論。通常是將兩種培養(yǎng)基按照一定的比例混合，混合的比例取決于不同細(xì)胞類型在實(shí)驗中的重要性[24]。共培養(yǎng)體系中兩種細(xì)胞的培養(yǎng)比例，在各種實(shí)驗中也有較大不同，大多數(shù)研究者按照1∶1的比例進(jìn)行實(shí)驗，成功獲得血管化的工程脂肪。但Strassburg等[12]的研究將兩者比例設(shè)在1∶10～1∶40間。究竟共培養(yǎng)體系中兩種細(xì)胞比例如何配置才能創(chuàng)建出理想的工程脂肪，血管化到什么程度才能既保證脂肪細(xì)胞長期存活，又可達(dá)到脂肪組織的功能？應(yīng)先將內(nèi)皮細(xì)胞種于支架并建立有效的血管網(wǎng)絡(luò)，還是先將MSC種于支架材料形成有效的脂肪？尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

5 脂肪組織工程中共培養(yǎng)體系的二維及三維培養(yǎng)

傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)主要用于研究共培養(yǎng)細(xì)胞間分子的相互作用，將間充質(zhì)干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞直接接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，通過細(xì)胞接觸或者旁分泌的細(xì)胞因子作用，比較觀察兩種細(xì)胞對彼此生長增殖及功能的影響，從而分析兩種細(xì)胞間相互作用的分子機(jī)制。三維培養(yǎng)是將兩種細(xì)胞種植于同一三維支架材料上，可以為構(gòu)建血管化工程脂肪提供更良好的微環(huán)境。三維培養(yǎng)能更好地模擬人體細(xì)胞的生長環(huán)境，分析細(xì)胞形態(tài)及微血管的形成與生長。

6 展望

過去很長一段時間，許多研究者專注于單一細(xì)胞生物材料的研究。然而，在人體生理環(huán)境中，絕大多數(shù)組織都是由2種或2種以上類型細(xì)胞所組成的多細(xì)胞系統(tǒng)，細(xì)胞相互之間的作用有利于細(xì)胞的生存與增殖，促進(jìn)生長因子等活性分子的產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞分化能力及其他關(guān)鍵的生物學(xué)作用。盡管共培養(yǎng)體系的構(gòu)建還存在諸多問題，如：適合各種細(xì)胞共培養(yǎng)的支架材料、培養(yǎng)基問題；各種不同類型細(xì)胞間的相互作用及機(jī)制；共培養(yǎng)體系中不同細(xì)胞的比例問題等。但最近共培養(yǎng)體系越來越多地引起人們的重視，逐漸成為組織工程發(fā)展的新方向。無論是從生理學(xué)還是生物學(xué)上講，共培養(yǎng)體系都更加接近天然組織，具有不同類型細(xì)胞間相互作用的特性。相信在不久的將來，隨著實(shí)驗技術(shù)與方法的不斷改進(jìn)，共培養(yǎng)體系將成為構(gòu)建血管化脂肪組織工程的重要策略，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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730050 甘肅 蘭州,蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院 全軍燒傷整形中心

劉剛強(qiáng)(1985-)，男，甘肅天水人，住院醫(yī)師，碩士研究生.

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.12.013

2014-08-15)