王麗杰 郭其森

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，其已占各種癌癥病死率之首[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占所有肺癌的80%～85%，其中約25%～30%就診時已是疾病晚期，約40%～50%已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因而失去手術(shù)切除機(jī)會，全身化療是其主要的治療手段。目前，以鉑類為基礎(chǔ)聯(lián)合第三代抗腫瘤藥物(吉西他濱、長春瑞濱、紫杉類藥物等)的化療方案是晚期NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但化療有效率也僅為30%～40%，而且很多患者因副反應(yīng)嚴(yán)重，而難以耐受。因此探尋效率高，副反應(yīng)輕的抗腫瘤藥物已成為肺癌治療的目標(biāo)。

隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制及其生物學(xué)行為研究的不斷深入，分子靶向治療作為目前NSCLC最具應(yīng)用前景的研究，已經(jīng)得到人們的普遍關(guān)注。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)作為最早被研究的靶點，已經(jīng)涌現(xiàn)出許多針對這些靶點的分子靶向藥物，如吉非替尼、鹽酸厄洛替尼、西妥昔單抗、貝伐珠單抗等，并取得了較好的臨床應(yīng)用效果。但由于NSCLC患者分子類型上的差異，導(dǎo)致了臨床實踐中患者對同一靶向藥物療效的顯著不同。例如，肺腺癌為EGFR-TKIs的優(yōu)勢人群，但即便同樣身為肺腺癌患者，使用EGFR-TKIs后，有些可以獲得疾病的長期緩解，有些會在TKIs初始有效后出現(xiàn)獲得性耐藥，還有一些患者則原發(fā)性耐藥。目前，針對EGFR-TKIs的耐藥機(jī)制所進(jìn)行的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：在原有突變基礎(chǔ)上，EGFR20號外顯子上C-T堿基置換后導(dǎo)致的T790M的錯義突變(49%)、MET癌基因的擴(kuò)增(5%)、病理表型由NSCLC轉(zhuǎn)化為SCLC(14%)以及PTEN表達(dá)缺失導(dǎo)致的AKT信號活化(5%)等都與EGFR-TKIs獲得性耐藥有關(guān)，K-ras基因突變則是產(chǎn)生原發(fā)耐藥的相關(guān)機(jī)制之一[2-5]。2007年發(fā)現(xiàn)的棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4-間變性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated protein-like 4 - anaplastic lymphoma kinase ，EML4- ALK )融合基因，其與EGFR突變及K-ras突變的不共存現(xiàn)象以及含有該基因患者的鮮明臨床特征[6]，都提示該靶點很有可能是繼T790M、K-ras之后EGFR-TKIs耐藥的又一重要機(jī)制，而且作為肺腺癌特異性較高的分子標(biāo)記物，已開始引領(lǐng)新的臨床靶向治療，因此備受各界關(guān)注。現(xiàn)就EML4-ALK融合基因的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)，檢測方法，臨床特征及臨床應(yīng)用研究等進(jìn)行綜述。

一、EML4-ALK融合基因的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)特征

2007年Soda等[6]通過構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒cDNA 文庫的方式，從一名62歲的日本男性吸煙肺腺癌患者手術(shù)切除的標(biāo)本中，擴(kuò)增篩選出了一個由3926 bp組成的新型DNA片段，該基因可以編碼一個由1059個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。該蛋白的氨基端是由人類EML4編碼蛋白的一部分構(gòu)成，而羧基端則是人類ALK編碼蛋白的一部分。因此他們認(rèn)為，這一基因很有可能是由EML4基因和ALK基因融合而成。進(jìn)一步研究證實，該融合基因是由分別位于人類2號染色體的p21基因片段EML4 和p23基因片段ALK倒位融合，即inv (2) (p21p23)，并重排為EML4-ALK融合基因，導(dǎo)致異常酪氨酸激酶表達(dá)，而且可使被轉(zhuǎn)染該融合基因的小鼠3T3成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞。

EML4屬于棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣蛋白家族[7]，其結(jié)構(gòu)由N末端堿基區(qū)，疏水的棘皮動物微管相關(guān)蛋白區(qū)(hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein)以及WD重復(fù)區(qū)3部分構(gòu)成[8]。其中，N末端堿基區(qū)在EML4-ALK 融合蛋白生成中起重要作用，而靠近N 端的 CC 區(qū)全部由 EML4 的 2 號外顯子編碼，HELP 區(qū)或WD 重復(fù)區(qū)的缺失會使激酶的活性降低50%以上[6]。

ALK是受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)家族的胰島素受體亞族成員，于1994年首先在間變性大細(xì)胞淋巴瘤AMS3細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)，其是由1620個氨基酸組成的跨膜蛋白[9]。該蛋白由膜外部分、跨膜區(qū)域以及膜內(nèi)催化區(qū)域組成，下游信號通路為Ras-ERK，JAK3-STAT3，以及PI3-K/Akt等。這些通路與細(xì)胞增殖、存活、遷移密切相關(guān)，其異?？蓪?dǎo)致腫瘤形成[10-13]。

目前為止，在肺癌細(xì)胞中已鑒定出多種EML4-ALK融合基因的變異體。EML4 基因從染色體上斷裂分離，裂解成不同長度的片段，插入 ALK 基因 20 外顯子內(nèi)[14]，正是由于斷裂截點的差異，形成了不同的融合基因型。到目前為止，已經(jīng)檢測到近20種 EML4-ALK 融合基因變異體[15-18]，其中最常見的是變異體1和變異體3，即EML4 的13號外顯子與 ALK 的20號外顯子的融合，及EML4 的 6a/b 外顯子與 ALK 的20號外顯子的融合。曾有文獻(xiàn)報道這兩者約占 NSCLC中 EML4-ALK 融合基因的60%，其余融合基因變異體比例相對較低[19]。Soda等[20]利用小鼠模型完成的體外轉(zhuǎn)化實驗表明，不同的EML4-ALK融合基因變異體均具有惡性轉(zhuǎn)化和致瘤能力。Zhang等[21]發(fā)現(xiàn)已知的不同EML4-ALK融合基因變異體其酪氨酸激酶活性程度有明顯差異，猜測可能對臨床用藥劑量具有一定的指導(dǎo)價值。但是關(guān)于變異體的問題還有待更進(jìn)一步的研究。

二、EML4-ALK融合基因的檢測方法

目前比較常用的EML4-ALK 融合基因的檢測方法有：免疫組織化學(xué)方法(immunohistochemistry, IHC),逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerasechain reaction, RT-PCR)，熒光原位雜交方法(fluorescence in situ hybridization, FISH)。由于上述方法都有各自的優(yōu)缺點，雖然在很多研究中，如在克里唑替尼的Ⅲ期臨床試驗(Profile-1007)中，F(xiàn)ISH被認(rèn)為是所謂的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而RT-PCR和IHC也因具有各自的優(yōu)勢，被廣泛用于臨床檢測及研究中。

FISH 采用探針特異性標(biāo)記細(xì)胞核中 ALK 斷裂點來檢測重排的ALK，分離的熒光信號提示存在 ALK 重排[22]。其優(yōu)點是可以從病理切片或細(xì)胞涂片上檢測少數(shù)細(xì)胞的融合變異，其敏感性和特異性均相對較高，當(dāng) IHC不能確定有無突變存在時可用此法進(jìn)行確認(rèn)。但與其他實驗技術(shù)一樣，F(xiàn)ISH的結(jié)果也受到一些因素的影響，如標(biāo)本固定時間長、烤片溫度過高、蛋白消化不當(dāng)、變性溫度差異，都會使熒光信號減弱或無信號。而且該法所觀察到的信號不能區(qū)分不同的EML4-ALK 融合基因變異體，且價格昂貴等，都是限制該方法被廣泛臨床應(yīng)用的因素。

RT-PCR作為最早用于EML4-ALK 融合基因檢測的方法，具有診斷快速、敏感性高的特點，應(yīng)用范圍廣，不但可以同時檢測多個已知亞型，還可以結(jié)合測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)新的亞型，即使在只有很少 EML4-ALK突變細(xì)胞的情況下也能檢測到突變的存在。但此種方法對RNA的質(zhì)量要求高，需要高純度的mRNA，所以對于新鮮標(biāo)本的檢測，其陽性率較高，但是臨床上多數(shù)組織標(biāo)本都用福爾馬林固定、蠟塊包埋，RNA 大量降解而使其靈敏度降低。而且RT-PCR技術(shù)對實驗室要求高，所以也難以成為檢測EML4-ALK的常規(guī)方法。

IHC 操作簡便，是最常用的檢測方法。其通過檢測腫瘤特異性抗原的表達(dá)，從而確定有無融合，并且它可同時鑒別正常組織和病理組織的結(jié)構(gòu)特征，做到快速篩選。但是其同樣不能分辨出具體的 ALK 融合基因類型，而且由于腫瘤組織中 ALK 蛋白的表達(dá)微弱和局限，其檢測的敏感性相對 RT-PCR 和 FISH 法要低。當(dāng)其對檢測陽性有模糊時，需用 FISH 等技術(shù)來驗證。

除上述方法外，還有RACE-偶聯(lián)PCR測序法(rapid amplification of cDNAends-coupled PCR)，該方法采用含有逆轉(zhuǎn)錄的RACE結(jié)合兩輪PCR技術(shù)來富集擴(kuò)增含有ALK的融合變體，其敏感度大大提高。該方法不僅可檢測EML4與ALK的融合，并明確其變異體類型，而且也可以檢測其它基因與ALK的融合，從而發(fā)現(xiàn)新的融合基因[21]。Yoshida等[23]報道采用顯色原位雜交法( CISH) 檢測 EML4-ALK 融合基因，發(fā)現(xiàn)該法可以保存組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)，大大促提高用常規(guī)光鏡對信號的評價，而且可用于福爾馬林固定的石蠟切片，其敏感性高、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性與 FISH 相同。此兩種方法因其獨特的優(yōu)點，顯示未來臨床應(yīng)用前景良好。

三、EML4-ALK融合基因的臨床特征

EML4-ALK融合基因作為NSCLC形成及進(jìn)展的關(guān)鍵驅(qū)動基因，被認(rèn)為將是NSCLC治療的新靶點。但猶如EGFR的研究歷程一樣，想要針對它的靶向治療成功，就必須明確其臨床特征，選定適合的人群，提高陽性檢出率。因此，不少學(xué)者進(jìn)行了EML4-ALK融合基因的臨床特征研究。

Soda 等[6]應(yīng)用 RT-PCR的方法對于75 例日本 NSCLC患者的組織標(biāo)本進(jìn)行了EML4-ALK融合基因、EGFR18、19、21號外顯子突變，以及 K-ras突變的檢測，發(fā)現(xiàn)5例患者存在 EML4-ALK融合基因，陽性率為6.7%。同時發(fā)現(xiàn)該基因陽性的患者，其 EGFR 以及 K-ras突變都為陰性。他們還分別檢測了39例急性髓性白血病患者，69例非霍奇金淋巴瘤患者，93例胃癌患者及60例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織標(biāo)本，但未發(fā)現(xiàn)一例EML4-ALK融合基因陽性者，因而他們曾預(yù)測該融合基因是NSCLC的特異突變基因。但是后來的研究發(fā)現(xiàn)，其他多種腫瘤也可檢出EML4-ALK 融合基因，但仍以組織類型為腺癌、少吸煙或不吸煙且EGFR和K-ras突變陰性的NSCLC患者多見[24]。

2009 年，Shaw 等[25]報道了141例 NSCLC 患者的 EML4-ALK融合基因情況。該研究為了進(jìn)一步提高陽性檢出率，要求入組患者必須具備以下特征中的兩項或更多：女性、亞裔、無或少量吸煙史(每年吸煙≤10 包或戒煙≥1 年)、腺癌。結(jié)果顯示19例(18例腺癌，1例腺鱗癌，并且大部分為印戒細(xì)胞癌)患者存在 EML4-ALK 融合基因，其發(fā)生率為 13%。其中，較年輕(P<0.001)、男性(P=0.036)、不吸煙或少量吸煙患者陽性率較高，而且在非EGFR突變且非吸煙患者中，陽性率更高，達(dá)33%。該研究還證實了EML4-ALK 融合基因與EGFR-TKIs的耐藥相關(guān)(P<0.001)。

為了解EML4-ALK融合基因在中國NSCLC患者中的發(fā)生率，Zhang等[21]運用 RACE-偶聯(lián) PCR 方法檢測了103例 NSCLC 患者EML4-ALK融合基因的情況。結(jié)果顯示該融合基因發(fā)生率為11.6%(12/103)，腺癌中的發(fā)生率為16.13%(10/62)，非吸煙者的發(fā)生率為19.23%(10/52，P=0.03)，在無 EGFR 或 K-ras 突變的腺癌患者中的發(fā)生率更高，為 42.80%(9/21，P=0.04)。由此認(rèn)為，EML4-ALK 融合基因在中國NSCLC患者，尤其是在無K-ras和EGFR突變的肺腺癌患者中的發(fā)生率更高。

雖然以上研究發(fā)現(xiàn)EML4-ALK 融合基因陽性的患者都無EGFR和K-ras基因突變，但此后陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，EML4-ALK 融合基因與 EGFR突變有共存現(xiàn)象，雖然罕見，但依然存在。目前文獻(xiàn)[21,26-29]已報道了十幾名共存病例患者，其中多例接受EGFR-TKIs治療后，少數(shù)達(dá)完全緩解(CR)或部分緩解(PR)，多數(shù)進(jìn)展(PD)或短期穩(wěn)定后進(jìn)展，PD的患者改服ALK抑制劑后可達(dá)CR或PR，且緩解時間有的長達(dá)9個月。所以關(guān)于EML4-ALK 融合基因與 EGFR突變及EGFR-TKIs療效的關(guān)系，尚待更深入的研究。

四、EML4-ALK融合基因的臨床應(yīng)用研究

EML4-ALK融合基因是具有致瘤性的變異基因，從它被發(fā)現(xiàn)起，針對ALK的抑制劑就被廣泛關(guān)注與研究。Soda等[20]在EML4-ALK融合基因轉(zhuǎn)染所形成的裸鼠腫瘤模型實驗中發(fā)現(xiàn)，小分子ALK抑制劑能夠顯著抑制小鼠腫瘤結(jié)節(jié)的生長。隨后針對ALK融合基因抑制劑的研究被陸續(xù)報道，截止目前，至少有9種不同類型的小分子ALK抑制劑正在研發(fā)試驗[30]。

PF-02341066 (Crizotinib，克里唑替尼)是全球首個口服的ALK抑制劑，它通過選擇性競爭ATP，抑制活化的ALK的酪氨酸磷酸化，阻斷下游信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞生長存活。

2009年Kwak等[31]首先報告了克里唑替尼治療19例EML4-ALK陽性的NSCLC患者，取得了令人鼓舞的53%的有效率。其副作用主要為可控制，易耐受的惡心、嘔吐、乏力、腹瀉等消化道癥狀。之后，在第46屆ASCO會議上，發(fā)布了一組克里唑替尼Ⅰ/Ⅱ期臨床實驗結(jié)果[32]。該研究通過FISH檢測具有EML4-ALK融合基因的NSCLC患者，共入組了82例，中位年齡51歲，其中79例(96%)患者為肺腺癌，大部分從不吸煙或少量吸煙，既往接受治療的中位次數(shù)為3次，ECOG評分均在0～2之間。所有患者口服克里唑替尼250 mg，bid。結(jié)果，顯示47例(57%)獲PR或CR，緩解持續(xù)時間1～15個月，27例患者疾病穩(wěn)定(SD)。8周疾病控制率(DCR)為89%，約72%的患者6個月無疾病進(jìn)展。隨后Camidge等[33]又公布了該試驗的更新數(shù)據(jù)，從2008年8月到2011年6月，共有149 例患者參與試驗，143 例可評價療效，87例(60.8%)獲客觀緩解 ，包括 3例CR和84 例PR。從服藥至獲可評價客觀反應(yīng)的中位時間為7.9周，中位緩解持續(xù)時間為49.1周，中位無進(jìn)展生存期為9.7個月。6個月和12個月的總存活率分別為87.9%和74.8%。觀察到的藥物副反應(yīng)主要為Ⅰ/Ⅱ級，其最常見的是視力障礙、惡心、嘔吐、腹瀉、浮腫、便秘。這些結(jié)果更進(jìn)一步驗證了Kwak等[31]的報道，使人相信克里唑替尼治療NSCLC患者的確有效。由于克里唑替尼安全，耐受性好，快速有效的抗腫瘤特性，加上 EGFR-TKIs的臨床應(yīng)用經(jīng)驗，美國FDA批準(zhǔn)其直接進(jìn)人Ⅲ期臨床試驗，并且在缺乏Ⅲ期臨床研究結(jié)果的情況下，該藥已經(jīng)于2011年8月得到美國FDA的批準(zhǔn)，用于治療ALK陽性的局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC。

隨著藥物的應(yīng)用和研究的深入，克里唑替尼還被檢測到對c-MET和ROS1兩個靶點也具有顯著的抗腫瘤作用[34-35]。但是像其他的靶向藥物一樣，ALK抑制劑也不可避免的出現(xiàn)了臨床耐藥性[36-37]。研究人員為克服其耐藥性，也正在積極探索，如積極研究其耐藥機(jī)制，探索二代ALK抑制劑，更加準(zhǔn)確的甄別敏感人群，尋找較好的聯(lián)合用藥模式等。

五、展望

EML4-ALK融合基因作為近幾年被發(fā)現(xiàn)的致瘤變異基因，因其具有獨特的臨床病理特征與相對高的陽性率，現(xiàn)已成為了晚期NSCLC臨床治療的新靶點。其中腺癌、少吸煙或不吸煙、更年輕、EGFR與K-ras 突變陰性的NSCLC患者陽性檢出率較高。目前檢測EML4-ALK融合基因的技術(shù)，主要包括FISH，RT-PCR和IHC，但新的更好的檢測技術(shù)仍需被積極探尋。根據(jù)現(xiàn)今靶向治療的臨床應(yīng)用情況，應(yīng)按照K-ras,EGFR,EML4-ALK的順序，依次核實患者基因突變情況來指導(dǎo)臨床用藥。ALK抑制劑的出現(xiàn)及臨床應(yīng)用，給該基因陽性患者帶來了希望，其中克里唑替尼在中國也已完成其Ⅲ期臨床研究，并于2013年2月獲得中國食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)的批準(zhǔn)在國內(nèi)上市，用于NSCLC的治療。但其耐藥性是該靶向治療的新難題。繼續(xù)進(jìn)行更加深入的實驗和臨床研究來解決耐藥等問題，才能進(jìn)一步提高NSCLC患者靶向治療的療效和患者的生存質(zhì)量。

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