郭斂容 蘇永進 王芬 蔡智 林宜玲

人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)可致人類皮膚和黏膜異常增生，引起多種良、惡性病變［1］。HPV感染與疾病的相關(guān)性在近年國內(nèi)外刊物中均有報道，尤其是HPV感染在尖銳濕疣、宮頸癌中研究較多，但在喉乳頭瘤中報道較少。目前臨床上公認的HPV檢測方法當屬第二代雜交捕獲(hybrid captureⅡ，HC-Ⅱ)技術(shù)［2］，但其缺點是不能具體對 HPV基因型分型，不能判斷多重感染。導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)(flow-through hybridization and gene chip)，即凱普導(dǎo)流雜交HPV DNA檢測法(簡稱HybriMax)［3］是 HPV基因型分型檢測的新方法。本文對36例喉乳頭瘤患者、30例聲帶息肉患者的標本及20例宮頸細胞標本進行了導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)HPV檢測，報告如下。

1 資料與方法

1.1 資料 2010年3月～2012年10月本院收治的喉乳頭瘤患者36例，年齡25～64歲，平均36.4歲;聲帶息肉患者30例，年齡23～60歲，平均33.5歲。取支撐喉鏡下手術(shù)切除部分標本，置于液氮中，-76℃保存。所有患者經(jīng)最后病理確診。取本院婦科門診宮頸細胞標本 HC-Ⅱ檢測陰/陽性各10份，同時留取行HybriMax技術(shù)檢測標本1份，標本置于-76℃保存。所有標本采集和診治過程均經(jīng)就診者本人同意。

主要試劑包括基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(凱普公司)、HPV分型檢測試劑盒(凱普公司)、HybriMax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀(HHM-2)(凱普公司)及HC-II試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 HPV分型檢測 采用 HybriMax技術(shù)檢測HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、81 型共 21 種亞型?；驹硎窍葘⒉《净虻腄NA進行基因擴增，然后利用核酸分子快速導(dǎo)流雜交技術(shù)法，使目的分子導(dǎo)流穿過固定有DNA探針的低密度基因芯片薄膜上而發(fā)生快速雜交。實驗步驟:樣本 HPV DNA提取，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增，核酸分子快速導(dǎo)流雜交，結(jié)果判讀，按芯片上HPV亞型分布的相應(yīng)著色位點判斷。有兩型或以上屬多型感染。具體如下:①DNA提取。組織懸浮在200 μL溶液P和40 μL蛋白酶K中，震蕩混勻;56℃孵育過夜;加入200 μL溶液L，75℃溫浴10 min;將液體轉(zhuǎn)入帶硅膠柱的2 mL離心管中，通過數(shù)次離心，最后加入100 μL的TE洗脫液，棄柱得DNA。②HPV-DNA的擴增。按照試劑盒說明書擴增程序進行PCR擴增反應(yīng)。

1.2.2 導(dǎo)流雜交法檢測HPV基因分型 20 μL生物素標記的PCR產(chǎn)物經(jīng)過變性，與500 μL預(yù)熱至45℃的雜交緩沖液混合，在導(dǎo)流雜交儀HybriMax上45℃孵育15 min，然后進行導(dǎo)流雜交。雜交后，再用0.8 mL雜交緩沖液沖洗3次。在25℃條件下，用封阻液封阻孵育 5 min。封阻后，加入 0.5 mL酶標液，孵育3.5 min。用沖洗緩沖液A沖洗雜交膜，去除未結(jié)合的酶標液，顯色過程加入0.5 mL NBT/BCIP底物，在36℃保持3～5 min或直至顯色完成。在顯色后1 h內(nèi)查看結(jié)果。

1.2.3 HC-Ⅱ法檢測 HPV HC-Ⅱ法檢測 HPV基因型:操作步驟及結(jié)果判定嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件，HybriMax檢測方法與HC-II法檢測結(jié)果符合情況采用一致性檢驗，計算靈敏度與特異度。不同組別HPV陽性率差異采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染型別分布 36例喉乳頭瘤病變樣本中18例HPV亞型被檢出，HPV陽性率50%(18/36)，檢出的 HPV亞型有 2種，依次為HPV 6型(33.33%、12/36)、11 型(16.67%、6/36)。HybriMax 技術(shù)檢測全部30例聲帶息肉標本，均未檢出HPV。χ2檢驗統(tǒng)計分析兩者陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 HybriMax技術(shù)與HC-Ⅱ法檢測的一致性分析HC-Ⅱ法檢測HPV陽性的宮頸細胞標本，HybriMax技術(shù)均檢出HPV，亞型分別為52、59、68型，其中52型50%(5/10)、58 型 30%(3/10)、59 型 20%(2/10)。HC-Ⅱ法檢測HPV陰性的宮頸細胞標本，HybriMax技術(shù)檢測1例為HPV陽性，亞型為53型，其余標本均為陰性。敏感度為100%，特異度為90%。

3 討論

HPV是一組病毒的總稱，根據(jù)DNA限制性內(nèi)切酶核殼體蛋白質(zhì)的抗原性不同，目前已經(jīng)確定的亞型最少有70種［4］。HPV根據(jù)其致癌的危險性分為高危型、低危型及中間型。低危型包括 HPV6、11、13、32等，可引起皮膚、黏膜良性病變;高危型常在癌變組織中檢出，主要有 HPV16、18、45、52、56 型等;中間型有HPV 31、33、35型等，在良、惡性組織中均能檢出，但不是主要型別［5］。目前HPV與宮頸病變的關(guān)系研究較多，且已明確高危型HPV的持續(xù)感染是宮頸癌的病因。對HPV感染的檢測和分型是處理宮頸病變的重要依據(jù)。臨床上可觀察到以下現(xiàn)象:成人喉乳頭瘤存在一定惡變率，兒童喉乳頭瘤易復(fù)發(fā)。普遍認為存在上述現(xiàn)象的原因在于:喉乳頭瘤的發(fā)病與HPV感染有關(guān);不同組病例感染亞型不同，導(dǎo)致不同的轉(zhuǎn)歸［6］。隨著技術(shù)的發(fā)展，病毒基因分型新方法的出現(xiàn)使得HPV分型成為可能。早在1995年就有學(xué)者采用多重PCR和原位雜交技術(shù)檢測成人喉乳頭瘤中HPV感染情況，陽性率為16.67%［7］。PCR檢測方法的成熟，使得臨床可以檢測常見的 HPV 6、11、16、18等分型。有文獻［8］報道喉乳頭瘤中HPV檢出率在33.3%左右。有學(xué)者用更為先進的熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測兒童喉乳頭瘤組織HPV DNA，結(jié)果顯示 HPV6型和HPV11型病毒的檢出率為88.46%［9］。原位雜交技術(shù)和PCR檢測方法只能檢測少量亞型，且操作較復(fù)雜，不能大規(guī)模地適用于臨床檢驗，限制了其臨床研究發(fā)展。

目前國際上常用的HC-Ⅱ技術(shù)，是迄今為止唯一獲得美國食品與藥品管理局認證用于臨床的HPV檢測手段，已廣泛應(yīng)用于臨床，但其缺點是不能檢測HPV基因型具體分型，高危型和低危型不能同時檢測，不能判斷多重感染。而HybriMax能同時對21種HPV基因型進行分型檢測，是目前針對HPV最先進的檢測方法。該技術(shù)在宮頸癌中已得到印證與推廣［10-11］，但尚無文獻報道其應(yīng)用于喉乳頭瘤的檢測。本次實驗結(jié)果顯示，10例應(yīng)用HC-Ⅱ技術(shù)檢測陽性的宮頸細胞標本 HybriMiax技術(shù)均檢出 HPV，表明HybrMiax技術(shù)敏感度高，與HC-Ⅱ技術(shù)檢測結(jié)果一致性良好，且能對更多基因型確切分型。HC-Ⅱ法檢測HPV陰性標本，應(yīng)用HybriMax技術(shù)檢測HPV 1例為陽性，亞型為53型，可能因為HybriMax技術(shù)除了能檢測HC-Ⅱ法包含的HPV亞型外，還能檢測HPV66、53、81亞型。此外，HC-Ⅱ每次檢測的標本量大，更適合于大規(guī)模篩查。HybriMax法每次檢測的樣本量可根據(jù)實際情況在1～15個之間調(diào)整，更靈活。以上表明，HybriMax法應(yīng)用于喉乳頭瘤中HPV檢測顯示出明顯優(yōu)越性，是值得在臨床推廣的新方法［12］。

對喉乳頭瘤的發(fā)病機制，多數(shù)學(xué)者認為與HPV相關(guān)［13］。HPV感染在喉部主要引起喉乳頭瘤，多由HPV6、11型引起，而HPV在喉癌發(fā)病機制中的作用尚不明確［14-15］。有文獻［16］報道，HPV6、11 型與喉乳頭瘤相關(guān)，HPV16、18型多在疣狀癌及喉癌中表達。本次實驗采用HybriMiax技術(shù)檢測出HPV基因型2種，分別為HPV 6型和11型，與文獻報道相符。HPV6、11型屬于常見低危基因型，該型易引發(fā)呼吸道乳頭瘤［17］，其檢出率與文獻［18］報道相符。另外有研究［19］表明，HPV6和HPV11型感染可能與小兒復(fù)發(fā)性喉乳頭瘤密切相關(guān)。本研究在成人喉乳頭瘤患者HPV檢出率為50%，說明HPV可能在喉乳頭瘤發(fā)病中起一定作用，但并非唯一原因。成人喉乳頭瘤、兒童喉乳頭瘤以及喉癌中HPV的表達、基因型的區(qū)別也需進一步研究，這將在本課題的后續(xù)研究中得以實現(xiàn)。

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