楊麗娟，盛 坤，蔣志凱，劉朝輝，趙宗武

（新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000）

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥的研究進(jìn)展

楊麗娟，盛 坤，蔣志凱，劉朝輝，趙宗武

（新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000）

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有操作簡(jiǎn)便、成本低、實(shí)用性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于小麥遺傳轉(zhuǎn)化。綜述了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥的敏感基因型篩選、外植體類型選擇及轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化方面的研究進(jìn)展，對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥前景進(jìn)行了展望。

農(nóng)桿菌；遺傳轉(zhuǎn)化；小麥

小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物，利用植物基因工程技術(shù)進(jìn)行小麥遺傳改良，增強(qiáng)小麥抗病蟲和耐逆境能力，提高產(chǎn)量，改善品質(zhì)，是小麥遺傳育種的研究方向之一。當(dāng)前，用于小麥遺傳轉(zhuǎn)化的手段主要有基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管通道法。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法具有基因拷貝數(shù)低、轉(zhuǎn)基因沉默相對(duì)較少、轉(zhuǎn)移的基因片段較長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)（徐春暉等，2002）。根癌農(nóng)桿菌在土壤中含量極其豐富，能在植物組織中生長(zhǎng)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前應(yīng)用最為廣泛的植物轉(zhuǎn)化方法。

伴隨著農(nóng)桿菌介導(dǎo)的粳稻遺傳轉(zhuǎn)化體系日趨成熟，單子葉植物目前也能夠用這種方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化（Hamid等， 1994； Ye等， 2000）。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低，受體范圍廣等特點(diǎn)，但農(nóng)桿菌介導(dǎo)法也存在一定不足，如易受基因型特異性，宿主范圍的限制，再生細(xì)胞感受態(tài)與轉(zhuǎn)化細(xì)胞感受態(tài)不一致性和易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性等，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥有待于建立并完善其高效轉(zhuǎn)化體系。

1 敏感基因型篩選

小麥高頻再生系統(tǒng)是提高轉(zhuǎn)化率的首要保證，其中受體基因型是影響轉(zhuǎn)化率的重要因素。不同小麥基因型對(duì)農(nóng)桿菌侵染的敏感程度不同，篩選對(duì)農(nóng)桿菌敏感的小麥基因型對(duì)于小麥新品種選育和功能基因組研究具有重要意義。優(yōu)良小麥品種成熟胚再生性能和農(nóng)桿菌敏感性評(píng)價(jià)為進(jìn)一步利用細(xì)胞工程和基因工程途徑改良小麥奠定了基礎(chǔ)。

Bobwhite是常用的基因型（楊云霞，2005；王艷麗2006；衣大龍，2009）。王艷麗等（2005）利用含GUS基因的C58C1農(nóng)桿菌菌系轉(zhuǎn)化83個(gè)小麥基因型的幼穗，發(fā)現(xiàn)CA9924、北農(nóng)49、西農(nóng)2611、京冬11等基因型幼穗對(duì)農(nóng)桿菌侵染比較敏感；但農(nóng)桿菌侵染后小麥幼穗切段僅僅不斷膨大，幾乎不產(chǎn)生愈傷組織，難以獲得再生植株。張彬（2006）等人以3個(gè)栽培冬小麥品種運(yùn)豐優(yōu)、臨優(yōu)145、中優(yōu)9507的成熟胚愈傷組織為外植體研究發(fā)現(xiàn)，三種小麥基因型對(duì)根癌農(nóng)桿菌的敏感性存在顯著差異，以臨優(yōu)145最敏感。后猛（2008）以100份普通小麥品種（系）和4份二倍體及四倍體小麥為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及分化再生的研究，篩選出了愈傷組織出愈率高、愈組質(zhì)量好、分化能力強(qiáng)、成苗率高的山農(nóng)2618等多個(gè)優(yōu)良基因型材料。陶麗莉（2009）根據(jù)農(nóng)桿菌侵染后胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和抗性植株再生率，從41個(gè)小麥品種中篩選到了比較適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的CB037、06SKW28、邯6172、豫麥66、新春9號(hào)、輪選987、CA8694等基因型，其胚性愈傷組織誘導(dǎo)率都在10.0%以上，抗性植株再生率均高于2.0%。李欣（2012）等研究了12個(gè)優(yōu)良小麥新品種成熟胚再生率及其對(duì)農(nóng)桿菌侵染的敏感性，認(rèn)為周麥27、揚(yáng)麥19等品種適合進(jìn)行成熟胚培養(yǎng)，周麥18、揚(yáng)麥15等品種成熟胚適合進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。楊賽奇（2012）初步根據(jù)幼胚愈傷組織的組培特性對(duì)黃淮麥區(qū)95種主流普通小麥栽培品種進(jìn)行聚類分析，將所有基因型劃分成7個(gè)類群，不同小麥基因型對(duì)農(nóng)桿菌侵染的敏感程度不同，其中有一個(gè)類群有較好的組培特性。

2 外植體類型選擇

許多外植體都被嘗試用于小麥組織培養(yǎng)再生體系，包括幼胚、成熟胚、盾片、幼穗、幼葉、分生組織、根尖等。截至目前，小麥幼胚是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥的常用外植體，高效離體再生體系的建立是小麥遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵所在，外植體選擇是重要環(huán)節(jié)。小麥幼胚培養(yǎng)力高、植株再生能力強(qiáng)，被認(rèn)為是最理想的外植體材料，但小麥幼胚的取材受季節(jié)嚴(yán)格限制，而且存在著基因型單一、轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，并且農(nóng)桿菌侵染后導(dǎo)致小麥幼胚愈傷組織褐化死亡現(xiàn)象嚴(yán)重，一定程度制約了小麥基因工程育種和功能基因組研究的深入。

小麥成熟胚取材方便，不受季節(jié)、環(huán)境條件和植株發(fā)育狀況等因素的限制，個(gè)體間生理狀態(tài)一致，是開展小麥遺傳轉(zhuǎn)化較為方便的外植體。但是，小麥成熟胚植株再生率非常低，限制了成熟胚在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。但目前已有許多農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成熟胚的成功嘗試（Khurana等，2002； Patnaik等，2006； Ding等， 2009； Wang等， 2009）。

許多研究者用幼穗和花藥作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的外植體并獲得了成功。高春生（2006）等研究了在不同誘導(dǎo)和分化條件下幼穗愈傷組織誘導(dǎo)再生頻率及其差異，結(jié)果表明中部穗段是最好的外植體。陳梁鴻等（1999）利用基因槍轉(zhuǎn)化小麥幼穗愈傷組織，將EPSPS基因轉(zhuǎn)入了小麥，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。趙愛菊等（2011）采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)小麥花藥愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明不同基因型的花藥培養(yǎng)力存在顯著差異，其中小麥品種石4185和冀5265是小麥花藥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的良好受體基因型。張艷敏等（2003）以石4185、石6365的花藥愈傷組織為受體，進(jìn)行了甜菜堿醛脫氫酶和膽堿氧化物酶等目的基因的轉(zhuǎn)化，PCR檢測(cè)到陽(yáng)性抗性再生植株。Amoah等（2001）利用農(nóng)桿菌侵染小麥幼穗，研究了影響GUS基因在幼穗中表達(dá)的因素，但最終沒(méi)有獲得轉(zhuǎn)基因植株。黃益洪等（2002）分別以小麥幼穗和花藥為受體材料，利用不同農(nóng)桿菌菌株感染，發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌菌系、小麥基因型和外植體對(duì)轉(zhuǎn)化效果均有影響，幼穗侵染后GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率高于花藥。

多人研究結(jié)果表明農(nóng)桿菌可以侵染小麥植株（Hess等，1990； Mooney等， 1991；Langridge等，1992）。何道一等（2003）首次報(bào)道利用小麥開花期農(nóng)桿菌滴入小花的方法獲得了轉(zhuǎn)基因小麥植株。Zale等（2009）在小麥孕穗期將穗子從葉鞘中剝出，在農(nóng)桿菌菌液中浸泡1～2min，下一代經(jīng)巴龍霉素篩選和PCR、Southern檢測(cè)，證明獲得了轉(zhuǎn)基因植株。

Razzaq等（2005）將萌芽的小麥種子剝?nèi)ヅ哐壳?，暴露生長(zhǎng)點(diǎn)，細(xì)針刺傷生長(zhǎng)點(diǎn)后利用農(nóng)桿菌侵染，獲得了陽(yáng)性植株。Supartana等（2006）將小麥種子在水中浸泡1d，用蘸有農(nóng)桿菌的細(xì)針穿刺芽尖部位，2d后滅菌和春化處理，Southern雜交鑒定出5個(gè)農(nóng)藝性狀表現(xiàn)差異的轉(zhuǎn)基因株系。Zhao等（2006）以小麥莖尖為受體，獲得了帶有β-1，3-葡聚糖酶基因的抗白粉病植株。梁欣欣等（2007）利用農(nóng)桿菌感染小麥幼苗莖尖，經(jīng)在含有除草劑的培養(yǎng)基上篩選得到了抗性植株，進(jìn)一步對(duì)抗性植株進(jìn)行了PCR檢測(cè)。楊波等（2008）對(duì)不同苗齡小麥幼苗莖尖部位進(jìn)行刺傷后侵染處理30min時(shí)，其莖尖uidA基因瞬時(shí)表達(dá)率可達(dá)31%。

Risacher等（2009）描述了一種利用農(nóng)桿菌在植株上注射小麥未成熟籽粒的轉(zhuǎn)化方法，平均轉(zhuǎn)化率5%以上，30%～50%的轉(zhuǎn)化植株為單拷貝整合，轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀正常。

3 轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化

3.1 建立高效轉(zhuǎn)化體系

影響轉(zhuǎn)化效率的因素有菌株染色體背景、共培養(yǎng)方式、侵染濃度和時(shí)間、共培養(yǎng)條件、受體類型和生理狀態(tài)、預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基、接種方式、感受態(tài)細(xì)胞保存條件、植物基因型、靶細(xì)胞生理狀態(tài)及對(duì)轉(zhuǎn)化植株的篩選程序、外植體處理、再生篩選體系等因素。在受體基因型和受體類型限定的情況下，篩選劑種類和劑量、預(yù)處理方式、侵染時(shí)間等成為轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化的幾個(gè)重要影響因素。

Ding等（2009）利用含pBI121載體的LBA4404農(nóng)桿菌侵染小麥成熟胚，以組織化學(xué)染色檢測(cè)和分子檢測(cè)結(jié)果為依據(jù)，對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的影響因素進(jìn)行了探討，認(rèn)為干燥條件下共培養(yǎng)有利于農(nóng)桿菌對(duì)小麥細(xì)胞的侵染。張志清等（2006）使用川農(nóng)16、川麥32和川育16幼胚及愈傷組織，對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化中幾個(gè)重要影響因素進(jìn)行了研究，結(jié)果表明Kan不能抑制幼胚愈傷的生長(zhǎng)，G418不能很好地抑制住幼胚生長(zhǎng)，在小麥遺傳轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)愈傷和繼代階段L-PPT合適的篩選濃度是2～3mg/L。

3.2 輔助措施提高轉(zhuǎn)化效率

對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行電擊，利用高壓脈沖作用使細(xì)胞膜上形成可逆性的瞬間通道，從而使外源DNA分子進(jìn)入細(xì)胞，操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化效率高，電擊與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法結(jié)合使用可以提高轉(zhuǎn)化效率。接種時(shí)振蕩培養(yǎng)能打破細(xì)胞表面的氣泡，使農(nóng)桿菌與外植體的接觸面增大，有利于農(nóng)桿菌侵染。席夢(mèng)利等（2007）以杉木莖段為外植體置于侵染液中浸泡進(jìn)行振蕩接種獲得了抗性芽。該方法在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中的有效性尚未見報(bào)導(dǎo)，但可為提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率提供參考。于慧敏等（2005）利用GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的胚性愈傷組織小麥遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明超聲波處理30s與適宜的菌液濃度、侵染時(shí)間等因素的作用下可使轉(zhuǎn)化效率得到明顯提高。綜合利用這些優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件，可使小麥的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率提高3倍多。畢瑞明（2008）研究表明，在接種侵染過(guò)程中的負(fù)壓處理對(duì)小麥成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)沒(méi)有顯著影響，但對(duì)小麥成熟胚的遺傳轉(zhuǎn)化卻有顯著影響，負(fù)壓處理后轉(zhuǎn)化率最高較對(duì)照組提高了10.90倍，最高轉(zhuǎn)化率可達(dá)12.50%，同時(shí)能夠提高小麥成熟胚轉(zhuǎn)化效率。王旭明等（2012）報(bào)道了一種超聲波輔助的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將發(fā)芽的小麥種子經(jīng)超聲波處理20min后再經(jīng)農(nóng)桿菌浸染，4個(gè)小麥品種均得到抗性后代，而不經(jīng)超聲波處理的種子幾乎看不到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，而經(jīng)過(guò)超聲波處理的種子，幼苗基部的細(xì)胞轉(zhuǎn)化成功。利用超聲波輔助的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化小麥能產(chǎn)生可遺傳的后代。

4 發(fā)展前景

目前已經(jīng)有多種目的基因以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到小麥中（薛哲勇等，2004；奚亞軍等，2004；畢瑞明等，2006；劉偉華，2006；李林等，2011；黃望啟，2012）。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法操作簡(jiǎn)便、成本低、實(shí)用性強(qiáng)。此法可以轉(zhuǎn)移較大的DNA片段，而且所轉(zhuǎn)DNA很明確的為T-DNA左右邊界之間的序列。其基因插入的低拷貝性，有利于克服基因失活現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化比較溫和。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法不需要原生質(zhì)體培養(yǎng)再生的過(guò)程，其轉(zhuǎn)化受體可以是不同的植物組織。以上諸多優(yōu)點(diǎn)，使農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成為最具競(jìng)爭(zhēng)力的轉(zhuǎn)化方法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將代替基因槍法，成為轉(zhuǎn)基因研究的主體（周文麟等，1992）?；驑尫ㄅc農(nóng)桿菌法相結(jié)合的“Agrolistic”法，利用碳化硅纖維輔助的農(nóng)桿菌法，超聲波輔助的農(nóng)桿菌法以及農(nóng)桿菌法與病毒相結(jié)合的“Agroinfection”法等，都可不同程度提高農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化率，在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用也必將越來(lái)越廣泛。

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S512.035.3

A

1003-4749（2014）10-0008-05

2014-08-18

科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2012GB2D000266)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-3-2-35）

楊麗娟(1983-)，女，河南新鄭人，碩士，主要從事小麥分子遺傳育種工作。