■李嬌龍 張 俊 邱洪儀 楊 玲 譚靈琳 丁斌鷹

（1.武漢輕工大學動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室，湖北武漢430023；2.武漢泛華生物技術有限公司，湖北武漢430023）

來自環(huán)境及飼養(yǎng)管理中的各種因素會對肉雞造成應激，使其身體機能紊亂，生產性能下降，從而對肉雞生產造成嚴重的經濟損失[1-2]。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細菌細胞壁特有的結構成分[3]，能夠造成機體免疫應激。研究表明，LPS刺激顯著降低了AA肉公雞生長性能[4]，顯著增加了仔豬肝臟能量損耗[5]。此外，它還能夠刺激肝臟釋放細胞因子，引起機體免疫反應進而造成肝臟損傷[6]。Olinga等[7]研究表明，LPS刺激鼠肝細胞顯著增加了培養(yǎng)基中TNFα、IL-1β和IL-10的水平。

三丁酸甘油酯和三乳酸甘油酯分別是由丁酸和乳酸與甘油酯化而成的。二者都被證明具有良好的抑菌效果，能抑制炎性因子分泌，還能作為能源物質為機體供能[8-9]。Cox等[8]研究表明，肉雞日糧中分別添加0.5%的丁酸或乳酸能夠顯著降低消化道沙門氏菌水平。Zhang等[10]在肉雞日糧中添加0.1%的丁酸鈉顯著降低了血清IL-6、TNFα水平，說明丁酸能夠緩解免疫應激造成的機體損傷。但是，關于二種甘油酯對生長性能和肝臟損傷修復效果的比較還未見報道。本試驗的目的是通過對肉雞進行LPS多次刺激，建立了一個LPS多次刺激模型，來探究三丁酸甘油酯和三乳酸甘油酯對LPS引起的生長性能下降和肝臟損傷的修復作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

240只健康、體重(45.1±0.5)g的1日齡Cobb肉公雞，購于武漢正大畜牧有限公司。

三丁酸甘油酯、三乳酸甘油酯，純度為45%。均由武漢泛華生物技術有限公司提供。

LPS，大腸桿菌血清型O55:B5，購于Sigma公司。

1.2 試驗日糧

試驗日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗處理

試驗分兩期。

試驗Ⅰ期：240只體重基本一致的1日齡Cobb肉公雞，隨機分成3組（對照組、丁酸酯組和乳酸酯組），每組4個重復，每個重復20只雞。對照組飼喂基礎日糧，丁酸酯組和乳酸酯組分別飼喂在基礎日糧的基礎上添加0.1%三丁酸甘油酯和0.1%三乳酸甘油酯的試驗日糧。

試驗Ⅱ期：在試驗第22 d，從試驗Ⅰ期對照組選?。ò大w重基本一致的原則）20只雞分成對照組和LPS組（飼喂基礎日糧），從試驗Ⅰ期丁酸酯組、乳酸酯組各選10只雞為試驗Ⅱ期丁酸酯組、乳酸酯組（飼喂在基礎日糧的基礎上分別添加0.1%三丁酸甘油酯和0.1%三乳酸甘油酯的試驗日糧），每只雞單籠飼養(yǎng)。每組10個重復，每個重復1只雞。在第25、27、29 d上午8：00，對LPS組、丁酸酯組、乳酸酯組的試驗肉雞分別腹腔注射500 μg/kg體重的LPS，對照組注射相同劑量的滅菌生理鹽水。在此期間，每只試驗動物采食量控制在80 g/d，自由飲水。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗肉雞飼養(yǎng)在不銹鋼籠中，每籠20只雞。試驗期4周，室溫在第一周維持在32～33℃，第二周在30～32℃，后面兩周維持在26℃，并保持畜舍通風良好。試驗前3周，自由飲水與采食。

1.5 樣品采集與處理

試驗開始后，前三周每周對試驗肉雞稱重，記錄采食量。試驗第25 d注射LPS前和第30 d上午8:00前（均為禁食12 h后）稱重，并做好記錄。試驗第29 d中午12:00（注射LPS后4 h）對試驗動物頸靜脈采血15 ml，3 000 r/min離心15 min，分離血漿并于-80℃冰箱保存，待測。試驗第30 d上午8:00屠宰，剖開腹腔取肝臟切碎，然后迅速放入液氮中保存待測。

1.6 指標測定

1.6.1 生長性能的測定

生長性能包括1～21日齡肉雞采食量、平均日增重、料重比和LPS多次刺激期間即試驗25～29 d的平均日增重（ADG）。

1.6.2 血液生化指標的測定

用日立7020全自動生化分析儀測定谷丙轉氨酶（GPT）、谷草轉氨酶（GOT）、堿性磷酸酶（AKP）酶活。

1.6.3 腺苷酸水平的測定

采用反相高效液相色譜儀(Waters，美國)測定肝臟腺苷酸水平，方法參照劉堅等[11]的方法進行。將肝臟從液氮中取出，在液氮中研磨成粉末狀。迅速稱取0.1～0.2 g置于預冷的勻漿器中，加入2 ml預冷的1.5 mol/l高氯酸，冰浴勻漿，然后離心（4 ℃，3 000×g，10 min），取上清液1 ml緩慢加入0.4 ml 2 mol/l碳酸鉀溶液中和，再離心（4 ℃，3 000×g，10 min），取上清液，-80℃保存待測。

1.7 數據處理與統(tǒng)計分析

試驗數據采用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan's法多重比較，顯著水平為P＜0.05。統(tǒng)計結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 日糧添加二種甘油三酯對1～21日齡肉雞生長性能的影響（見表2）

表2 甘油三酯對1～21日齡肉雞生長性能的影響

由表2可知，日糧中添加0.1%的三丁酸甘油酯、三乳酸甘油酯對1～21日齡肉雞生長性能沒有顯著的影響（P＞0.05）。

2.2 日糧中添加二種甘油三酯對LPS多次刺激肉雞平均日增重的影響（見表3）

表3 甘油三酯對試驗25～29 d肉雞平均日增重(ADG)的影響

由表3可知，與對照組相比，LPS組平均日增重顯著降低了19.4%（P＜0.05）。與LPS組相比，丁酸酯組、乳酸酯組平均日增重分別提高了9.1%、10.2%（P＞0.05）。

2.3 日糧中添加二種甘油三酯對LPS多次刺激肉雞血液生化指標的影響（見表4）

表4 甘油三酯對LPS多次刺激肉雞血液生化指標的影響（U/l）

由表4可知，與對照組相比，LPS刺激升高了血漿GPT含量18.8%(P＜0.05)和GOT含量18.6%(P＜0.05)。與LPS組相比，日糧中添加0.1%的三丁酸甘油酯、三乳酸甘油酯分別使血漿GPT含量降低了15.4%（P＜0.05）、23.3%（P＜0.05），血漿GOT含量降低了15.2%（P＜0.05）、14.7%（P＜0.05）。與對照組相比，日糧中添加0.1%的三丁酸甘油酯、三乳酸甘油酯分別使血漿GPT和GOT含量變化不明顯（P＞0.05）。在AKP含量方面，LPS組與對照組、丁酸酯組與LPS組和對照組、乳酸酯組與LPS組和對照組之間差異不顯著（P＞0.05），但是丁酸酯組AKP含量比乳酸酯組的低25.09%（P＜0.05）。

2.4 日糧中添加二種甘油三酯對LPS多次刺激肉雞肝臟腺苷酸水平的影響（見表5）

表5 二種甘油三酯對LPS多次刺激肉雞肝臟腺苷酸水平的影響

由表5可知，與對照組相比，LPS刺激降低了肝臟ATP含量50.4%（P＜0.05）、ADP含量33.3%（P＜0.05）、AMP含量20.7%（P＜0.05）、TAN含量32.1%（P＜0.05）及EC 21.8%（P＜0.05），升高了AMP/ATP比值48.9%（P＜0.05）。與LPS組相比，日糧中添加0.1%三丁酸甘油酯、0.1%三乳酸甘油酯分別顯著提高了肝臟ATP含量 113%、81%（P＜0.05），ADP含量 61%、67.1%（P＜0.05），TAN含量45%、44.8%（P＜0.05）及EC 39.2%、22.6%（P＜0.05），分別降低了肝臟 AMP/ATP 比值44.4%、29.1%（P＜0.05）。同時與LPS組相比較，三乳酸甘油酯還提高了AMP含量27.2%（P＜0.05）。日糧中添加0.1%三丁酸甘油酯、0.1%三乳酸甘油酯，與對照組相比，在肝臟ATP、ADP、AMP、TAN含量和EC值差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 日糧中添加二種甘油三酯對1～21日齡肉雞生長性能的影響

本試驗表明，日糧中添加0.1%的三丁酸甘油酯、三乳酸甘油酯對非應激條件下肉雞生長性能并無顯著性影響。這與Zhang等[10]的結果是基本一致的。其原因可能是三丁酸甘油酯、三乳酸甘油酯都可以為動物體提供丁酸、乳酸等有機酸；而Leeson等[12]認為，營養(yǎng)狀況良好的健康肉雞在一個衛(wèi)生狀況良好，密度適中的環(huán)境下生長時，日糧添加有機酸對其生長并沒有顯著的效果。

3.2 日糧中添加二種甘油三酯對LPS多次刺激肉雞體增重的影響

LPS會對動物機體產生毒性作用，例如通過刺激多種細胞因子的大量分泌而引起炎癥反應，造成多器官損傷，影響機體新陳代謝等，最終影響了動物的正常生長[6,10,13]。本試驗結果顯示，在試驗第25～29 d，LPS顯著降低了肉雞平均日增重（P＜0.05），這與Lee?son等[12]和Zhang等[10]的研究結果是一致的。Zhang等[10]的研究表明，LPS多次刺激后，肉雞的生長性能顯著低于對照組。董曉鈴[4]也發(fā)現(xiàn)，LPS處理顯著降低了AA肉雞生長性能。大量研究表明，丁酸、乳酸不僅具有抗菌作用，還能增強機體免疫力，更能作為一種能量來源為機體供能。Zhang[10]的研究表明，添加0.1%的丁酸鈉可以顯著提高LPS刺激的肉雞日增重。在李瑞珍[14]的研究中日糧添加1.8%的乳酸顯著提高了仔豬日增重。在本試驗中，與LPS組相比，日糧中添加0.1%的三丁酸甘油酯、三乳酸甘油酯分別使平均日增重升高了9.1%、10.2%，但未達到顯著水平。

3.3 日糧中添加二種甘油三酯對LPS多次刺激肉雞血液生化指標的影響

GPT是在肝細胞內合成的，主要分布在肝細胞的胞質中，當肝細胞受損時會釋放入血，是反映肝細胞炎癥受損最敏感的指標。GOT可以從受損的肝細胞、心肌細胞、肌肉細胞或腦細胞中釋放入血。肝臟中的GOT主要存在于線粒體中，GOT升高說明細胞器受損，肝臟損害嚴重。肝臟中含有高濃度的AKP，血液中AKP升高是肝臟受損的一種表現(xiàn)。由此可見，血液中GPT、GOT和AKP濃度升高可能是由肝臟受損導致的。

本試驗中，LPS刺激顯著升高了血漿GPT和GOT水平。馮俊明等[15]的研究表明，LPS刺激庫普細胞后產生的活性遞質(TNFα、IL-6、NO)顯著升高了培養(yǎng)肝細胞上清的GPT、GOT水平，這與本試驗結果基本一致。營養(yǎng)物質在修復肝臟疾病方面起著重要的作用[16]。在本試驗中，與LPS組相比，日糧中添加0.1%三丁酸甘油酯、0.1%三乳酸甘油酯顯著降低了血漿中GPT、GOT水平。徐振飛等[17]和楊玲[18]的研究表明，日糧中添加丁酸鈉或三丁酸甘油酯均有降低斷奶仔豬血清GPT、GOT水平的趨勢（P＜0.05）。 Miyoshi等[19]給肝損傷的大鼠口服三丁酸甘油酯，發(fā)現(xiàn)三丁酸甘油酯抑制了NF-κB活性，從而減弱了肝損傷程度。Giest?ing等[20]建議，仔豬斷奶后受到應激刺激，添加三羧酸循環(huán)的中間產物如乳酸等將有助于緩解應激，減少體組織分解。Tsiloyiannis等[21]的研究也表明，日糧添加1.5%的乳酸緩解了大腸桿菌感染引起的仔豬疾病。以上結果表明，三丁酸甘油酯和三乳酸甘油酯均能緩解LPS引起的肝臟損傷，且二種甘油三酯之間效果差異不顯著。

3.4 日糧中添加二種甘油三酯對LPS多次刺激肉雞肝臟腺苷酸水平的影響

線粒體是機體能量轉化和物質代謝的中轉站，是機體所有氧化磷酸化的場所，為細胞各種活動供能[22]。ATP是機體中存在的直接能量形式，水解可生成ADP或AMP并伴有大量的能量產生，用于機體各項生命活動。與此同時，AMP通過氧化磷酸化和底物水平磷酸化獲得高能磷酸基團形成ATP，三者始終保持著動態(tài)平衡[5]。TAN是ATP、ADP和AMP三者之和，其大小反映了線粒體生成高能磷酸化合物的能力、氧化呼吸活性和細胞的能量儲備[5]。EC反映了高能磷酸鍵在ATP、ADP和AMP之間的相互轉換，是動態(tài)調節(jié)細胞能量平衡的一個參數，可有效評估能量儲備狀態(tài)[22]。

研究結果表明，LPS顯著降低了大鼠肝臟琥珀酸脫氫酶、細胞色素氧化酶活性和EC水平，嚴重影響了肝臟的能量代謝[22]。本試驗結果顯示，LPS顯著降低了肝臟ATP、ADP、AMP、TAN含量和EC水平，顯著升高了AMP/ATP。以上結果表明，LPS刺激增加了肝臟能量損耗，降低了能量儲備。Beauvieux等[23]通過對大鼠肝臟灌注丁酸和中鏈脂肪酸發(fā)現(xiàn)，丁酸和中鏈脂肪酸增加了肝臟呼吸活性，修復了肝臟能量代謝。中短鏈脂肪酸通過血液循環(huán)到達肝臟，進入線粒體經β-氧化生成NADH和FADH2，NADH和FADH2又進入電子呼吸傳遞鏈生成ATP。乳酸通過腸腔進入血液循環(huán)到達肝臟，在肝臟轉化為丙酮酸，丙酮酸可以進入三羧酸循環(huán)生成ATP[24]。本試驗研究結果與以上研究結果基本一致，與LPS組相比，丁酸酯組、乳酸酯組的肉雞肝臟ATP、ADP、TAN含量和EC水平都有顯著的升高。三乳酸甘油酯還顯著升高了肝臟AMP水平。以上結果表明，LPS刺激造成了肝臟腺苷酸水平發(fā)生了變化，能量儲備下降，而三丁酸甘油酯和三乳酸甘油酯均能緩解LPS造成的不利影響。

4 結論

本試驗結果顯示：LPS多次刺激顯著升高了血漿GPT、GOT水平，增加了肝臟的能量損耗；而日糧中分別添加0.1%三丁酸甘油酯和0.1%三乳酸甘油酯均顯著緩解了LPS多次刺激造成的肝細胞損傷和能量損耗，且二者之間并無顯著差異。