楊春華 毛立軍

多數(shù)溶瘤腺病毒直接瘤內(nèi)注射具有良好效果，全身靜脈應(yīng)用后機體免疫系統(tǒng)明顯影響療效［1］，細胞作為載體介導基因治療可逃避機體免疫從而克服這一瓶頸［2-3］，本文主要對間質(zhì)干細胞荷載溶瘤腺病毒治療腫瘤這一研究領(lǐng)域研究進展綜述。

1 間質(zhì)干細胞與腫瘤

宿主免疫可在病毒到達腫瘤之前消除循環(huán)中裸露的病毒。探索有效的病毒載體系統(tǒng)逃避機體的免疫并從而改善治療功效逐漸被廣泛關(guān)注。自身免疫系統(tǒng)對自身細胞無免疫力，因此將溶瘤病毒隱匿在自身細胞里可克服這一瓶頸，提供一種解決系統(tǒng)性運輸溶瘤病毒的方法。理想的載體細胞應(yīng)該能夠?qū)δ[瘤有靶向性。越來越多的證據(jù)顯示干細胞、祖細胞、免疫細胞以及癌細胞［4］具有這一特點，多能干細胞更加明顯［5］，如間質(zhì)干細胞和神經(jīng)干細胞，目前通過干細胞荷載病毒的傳遞正在成為一個廣泛使用的癌癥試驗性治療手段［6-7］。在轉(zhuǎn)移性乳腺癌、卵巢癌和惡性膠質(zhì)瘤的小鼠模型中已證實間質(zhì)干細胞荷載溶瘤腺病毒的可行性［8-11］。Dreier等［12］證明荷載干擾素-β（interferon-β，INF-β）人類間質(zhì)干細胞在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤小鼠肺模型中可抑制腫瘤生長并改善動物生存的效果，且來源于骨髓、脂肪或者臍帶等不同組織的間質(zhì)干細胞均被證實具有自然腫瘤靶向性，間質(zhì)干細胞對腫瘤的歸巢能力可能是由細胞因子和趨化因子介導，這種推論的證據(jù)來源于間質(zhì)干細胞存在這些趨性介質(zhì)的受體。進一步研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織生長的微環(huán)境中高濃度的細胞因子如成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子、血小板源性生長因子［4］、血管內(nèi)皮細胞生長因子、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、單核細胞趨化蛋白-l等有利于MSCs遷移到瘤床或其周圍。經(jīng)過間充質(zhì)干細胞復(fù)制后釋放出來病毒可在腫瘤細胞中復(fù)制，對腫瘤細胞產(chǎn)生明顯細胞病變效應(yīng)，并產(chǎn)生的一定誘導凋亡作用，且其凋亡率顯著高于直接用相同初始病毒劑量產(chǎn)生的殺傷作用。間充質(zhì)干細胞具有顯著歸巢于腫瘤組織的能力，24 h后主要分布于腫瘤組織邊緣，72 h后主要分布于腫瘤實體內(nèi)部。攜帶溶瘤病毒后的間充質(zhì)干細胞仍具歸巢能力，24 h間充質(zhì)干細胞主要分布于血流豐富的器官如肝、脾、肺。24 h后，肝、脾、肺組織中的間充質(zhì)干細胞逐漸減少，而腫瘤組織中間充質(zhì)干細胞數(shù)量明顯增多。

2 優(yōu)化溶瘤腺病毒轉(zhuǎn)導間質(zhì)干細胞效率

腺病毒血清5型（adenovirus serotype 5，Ad5）是使用最廣泛的一種有復(fù)制能力的腺病毒［12-13］。腺病毒血清型的纖維蛋白連接到柯薩奇病毒-腺病毒細胞受體的表面，在感染方面是第一個重要的步驟［14］。大多數(shù)潛在的細胞載體和惡性腫瘤細胞均低水平表達柯薩奇病毒-腺病毒受體。為克服這一限制，化學和基因修飾的腺病毒已經(jīng)被廣泛研究。

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）化學修飾是為避免病毒與中和抗體的結(jié)合，同時可減少病毒數(shù)量以限制病毒引起宿主的炎癥反應(yīng)［15］。將肽或配體連接于PEG鏈的末端可使腺病毒轉(zhuǎn)染具有組織靶向性。腫瘤和腫瘤相關(guān)的血管內(nèi)皮細胞表面過度表達αv整合素，而精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg Gly Asp，RGD）可特異性連接到整合素，利用RGD修飾聚乙二醇化的腺病毒可結(jié)合到內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞的αvβ3整合素蛋白［16］。此外，上皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）也已被證明，可以介導腺病毒轉(zhuǎn)染到EGF陽性細胞［17］。這種多肽與PEG化的腺病毒結(jié)合模式可傳遞不同種類病毒到相應(yīng)受體表達的載體細胞，實現(xiàn)靶向性。細胞與病毒粒子之間的電荷影響病毒基因轉(zhuǎn)移效率，通過中和細胞表面的唾液酸與病毒粒子之間的電荷排斥可以提高腺病毒感染細胞的效率。凝聚胺一種多聚陽離子，可提高體外逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒介導的基因轉(zhuǎn)導效率。這一策略也被用于腺病毒介導的基因轉(zhuǎn)移，證明能顯著提高病毒進入間質(zhì)干細胞效率且未影響間質(zhì)干細胞的生存能力。這個簡單的方法可以實現(xiàn)高效的基因傳導和病毒的生殖并不需進行復(fù)雜的遺傳修飾。

雖然化學修飾增加病毒傳導效率并前景樂觀，但是大規(guī)模生產(chǎn)卻是一種臨床挑戰(zhàn)。故通過Ad衣殼的基因修飾重新定位腫瘤的策略已被廣泛研究。AD5-delta24RGD是可以靶向整合素αvβ3的溶瘤腺病毒［18］，可高效轉(zhuǎn)染柯薩奇-腺病毒受體（coxsackie-adenovirus receptor，CAR）低表達的間質(zhì)干細胞，靜脈給予荷載Ad-RGD的間質(zhì)干細胞可高效轉(zhuǎn)染干細胞，且能夠轉(zhuǎn)運和釋放病毒顆粒到大腦原位膠質(zhì)瘤并最終導致提高荷瘤小鼠的存活率［19］。通過7個賴氨酸殘基［K7（KKKKKKK）肽］修飾腺病毒纖維蛋白HI環(huán)獲得（Ad-p7k）可以靶向硫酸乙酰肝素。Ad-p7k有良好的轉(zhuǎn)染效率，并提高數(shù)種荷瘤鼠的治療效果，在間質(zhì)干細胞的轉(zhuǎn)染效率提高是Ad5的400多倍，Ad-RGD的16倍［20-21］。

超過100個不同的腺病毒（Ads)分為6個亞型（A至F）。其中B亞型的腺病毒可以利用廣泛表達在細胞表面的CD46和其他未經(jīng)確認的蛋白作為受體進入宿主細胞。為實現(xiàn)在廣泛細胞類型的轉(zhuǎn)染，增加C亞型腺病毒載體的轉(zhuǎn)導速率。通過基因工程用B亞型的腺病毒纖維球結(jié)構(gòu)域取代C亞型的腺病毒纖維球結(jié)構(gòu)域，這種嵌合體除提高了轉(zhuǎn)染效率，還可以減少肝臟的嗜性，減輕肝臟的毒性，與未修飾的Ad5相比，增加循環(huán)時間。因此，嵌合的Ad5載體一定程度克服了未經(jīng)修飾的Ad5的感染載體細胞的限制。嵌合溶瘤腺病毒Ad5/3與Ad-RGD和Ad5比較對于卵巢癌和乳腺癌裂解能力明顯提高。靜脈注射荷載Ad5/3的間質(zhì)干細胞后能明顯改善轉(zhuǎn)移性腫瘤小鼠的存活率［22］。表達相對較低水平CD46的間質(zhì)干細胞，發(fā)現(xiàn)可以轉(zhuǎn)染Ad5F35，這也表明在Ad5F35轉(zhuǎn)染過程中，其他未知的受體也參與其中［23］。另外，與Ad5-RGD和Ad5/3相比，Ad5F35也展現(xiàn)出對惡性膠質(zhì)瘤特異的基因傳導和溶瘤作用，可見使用嵌合病毒作為載體細胞介導的腫瘤治療具有可行性。

Hamada等［24］評價利用卵巢癌起源的細胞載體荷載由IAI.3B啟動子調(diào)控的溶瘤腺病毒的治療效果，結(jié)果腫瘤細胞荷載溶瘤腺病毒對卵巢癌有治療效果。另外，利用正常的細胞載體MSC荷載CXC趨化因子受體4啟動子（C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4）調(diào)控的Ad可以靶向胸腺癌和惡性膠質(zhì)瘤。CXCR4啟動子調(diào)控的Ad在人間質(zhì)干細胞和膠質(zhì)細胞中的復(fù)制高出野生型E1A基因啟動子多倍。在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的小鼠模型中，與單獨靜脈注射Ad相比，人間質(zhì)干細胞介導的Ad-CXCR4經(jīng)靜脈注射后能顯著提高小鼠的存活率［25］。

3 展望

間充質(zhì)干細胞有跨時代的意義但仍有許多問題需要解決：1）免疫抑制作用持續(xù)時間長短、作用強弱，是否會增加機體感染概率、提高機體內(nèi)細胞惡性病變的可能性還不明確；2）自身致瘤性問題，目前存在較大爭議；3）由間充質(zhì)干細胞誘導分化而來的細胞具有這些組織細胞的形態(tài)和表型，但具有這些組織細胞功能的研究還需要大量的研究證實。靜脈注射間質(zhì)干細胞對大多數(shù)腫瘤有效，但缺乏充足證據(jù)，這種傳遞方式仍受到質(zhì)疑。如在腦腫瘤模型中，通過尾靜脈注射間質(zhì)干細胞缺乏對顱內(nèi)腫瘤的靶向性。為提高腫瘤靶向性，通過小鼠頸動脈注射荷載綠色熒光蛋白標記的腺病毒間質(zhì)干細胞可進入人腦膠質(zhì)瘤的局部，獲得明顯效果?？梢娡ㄟ^靶器官的動脈應(yīng)用間質(zhì)干細胞可克服間質(zhì)干細胞的歸巢特點非特定性。綜上所述，載體細胞歸巢和生物產(chǎn)品運行的特點及載體細胞可能對腫瘤生物學的影響需要進一步研究。細胞載體荷載溶瘤腺病毒和基因的模式仍需要從病毒的設(shè)計到載體細胞的制備、細胞和病毒的生命周期動力學到藥物代謝動力學多種類型專業(yè)知識的整合，未來需要所有研究領(lǐng)域的努力，才可能導致這項技術(shù)的臨床應(yīng)用。

1 Choi JW,Lee JS,Kim SW,et al.Evolution of oncolytic adenovirus for cancer treatment[J].Adv Drug Deliv Rev,2012,64(8):720-729.

2 Yong RL,Shinojima N,Fueyo J,et al.Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells for intravascular delivery of oncolytic adenovirus Delta24-RGD to human gliomas[J].Cancer Res,2009,69(23):8932-8940.

3 Qiao J,Kottke T,Willmon C,et al.Purging metastases in lymphoid organs using a combination of antigen-nonspecific adoptive T cell therapy,oncolytic virotherapy and immunotherapy[J].Nat Med,2008,14(1):37-44.

4 Lee DH,Ahn Y,Kim SU,et al.Targeting rat brain stem glioma using human neural stem cells and human mesenchymal stem cells[J].Clin Cancer Res,2009,15(15):4925-4934.

5 Shah K.Mesenchymal stem cells engineered for cancer therapy[J].Adv Drug Deliv Rev,2012,64(8):739-748.

6 Gjorgieva D,Zaidman N,Bosnakovski D.Mesenchymal stem cells for anti-cancer drug delivery[J].Recent Pat Anticancer Drug Discov,2013,8(3):310-318.

7 Josiah DT,Zhu D,Dreher F,et al.Adipose-derived stem cells as the rapeutic delivery vehicles of an oncolytic virus for glioblastoma[J].Mol Ther,2010,18(2):377-385.

8 Tobias AL,Thaci B,Auffinger B,et al.The timing of neural stem cell-based virotherapy is critical for optimal therapeutic efficacy when applied with radiation and chemotherapy for the treatment of glioblastoma[J].Stem Cells Transl Med,2013,2(9):655-666.

9 Ong HT,Federspiel MJ,Guo CM,et al.Systemically delivered measles virus-infected mesenchymal stem cells can evade host immunity to inhibit liver cancer growth[J].J Hepatol,2013,59(5):999-1006.

10 Huang YF,Chen MJ,Wu MH,et al.The use of hypoxic cultured mesenchymal stem cell for oncolytic virus therapy[J].Cancer Gene Ther,2013,20(5):308-316.

11 White KM,Alba R,Parker AL,et al.Assessment of a novel,capsid-modified adenovirus with an improved vascular gene transfer profile[J].J Cardiothorac Surg,2013,8(1):183.

12 Dreier B,Honegger A,Hess C,et al.Development of a generic adenovirus delivery system based on structure-guided design of bispecific trimeric DARPin adapters[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(10):E869-877.

13 Ballard EN,Trinh VT,Hogg RT,et al.Peptide targeting of adenoviral vectors to augment tumor gene transfer[J].Cancer Gene Ther,2012,19(7):476-488.

14 Harrington KJ.Oncolytic virotherapy needs trials,not access programs[J].Clin Cancer Res,2013,19(10):2595-2597.

15 Kim PH,Sohn JH,Choi JW,et al.Active targeting and safety profile of PEG-modified adenovirus conjugated with herceptin[J].Biomaterials,2011,32(9):2314-2326.

16 Gamble LJ,Ugai H,Wang M,et al.Therapeutic efficacy of an oncolytic adenovirus containing RGD ligand in minor capsid protein IX and Fiber,Δ24DoubleRGD,in an ovarian cancer model[J].J Mol Biochem,2012,15(1):26-39.

17 Park JW,Mok H,Park TG.Epidermal growth factor(EGF)receptor targeted delivery of PEGylated adenovirus[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,366(13):769-774.

18 Graat HC,van Beusechem VW,Schagen FH,et al.Intravenous administration of the conditionally replicative adenovirus Ad5-Delta24RGD induces regression of osteosarcoma lung metastases[J].Mol Cancer,2008,7:9.

19 Lamfers M,Idema S,van Milligen F,et al.Homingpropertiesofadipose-derived stemcellstointracerebralglioma and the effects of adenovirus infection[J].Cancer Lett,2009,274(1):78-87.

20 Ranki T,Kanerva A,Ristimaki A,et al.A heparan sulfate-targeted conditionally replicative adenovirus,Ad5.pk7-Delta24,for the treatment of advanced breast cancer[J].Gene Ther,2007,14(1):58-67.

21 Zheng S,Ulasov IV,Han Y,et al.Fiber-knob modif i cations enhance adenoviral tropismand gene transfer inmalignant glioma[J].J Gene Med,2007,9(3):151-160.

22 Komarova S,Kawakami Y,Stoff-Khalili MA,et al.Mesenchymal progenitor cells as cellular vehicles for delivery of oncolytic adenoviruses[J].Mol Cancer Ther,2006,5(2):755-766.

23 Knaan-Shanzer S,van de Watering MJ,van der Velde I,et al.Endowing human adenovirus serotype 5 vectors with f i ber domains of species B greatly enhances gene transfer into human mesenchymal stem cells[J].Stem Cells,2005,23(10):1598-1607.

24 Hamada K,Desaki J,Nakagawa K,et al.Carrier cell-mediated delivery of areplication-competent adenovirus for cancer gene therapy[J].Mol Ther,2007,15(6):1121-1128.

25 Sonabend AM,Ulasov IV,Tyler MA,et al.Mesenchymal stem cells effectively deliver an oncolytic adenovirus to intracranial glioma[J].Stem Cells,2008,26(3):831-841.