史業(yè)輝 周立艷 魏 楓 于津浦 賈勇圣 佟仲生

腫瘤疫苗聯(lián)合節(jié)拍化療對(duì)小鼠乳腺癌作用的研究*

史業(yè)輝 周立艷 魏 楓 于津浦 賈勇圣 佟仲生

目的：研究新型腫瘤疫苗聯(lián)合節(jié)拍化療對(duì)晚期乳腺癌小鼠模型的治療效果，并探討其作用機(jī)制。方法：以小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1接種Balb/c小鼠建立模型。利用含高遷移率核小體蛋白1（high-mobility group nucleosome binding protein 1，HMGN1）基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染4T1細(xì)胞，制備瘤苗。小鼠皮下接種4T1細(xì)胞，隨機(jī)分成生理鹽水對(duì)照組（NS組）、吉西他濱節(jié)拍化療組（MET組）、瘤苗組、節(jié)拍化療聯(lián)合瘤苗組（聯(lián)合組）4組。觀察各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)及不良反應(yīng)，并檢測(cè)腫瘤局部調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）的Foxp3表達(dá)及腫瘤微血管密度（microvessel density，MVD）的變化。結(jié)果：聯(lián)合組腫瘤體積明顯小于MET組及瘤苗組（P＜0.05），與NS組比較有顯著性差異（P＜0.001）。Western blot和免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組與MET組小鼠腫瘤局部浸潤(rùn)Tregs的Foxp3表達(dá)及腫瘤MVD明顯減少（P＜0.05）。各治療組未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。結(jié)論：HMGN1基因修飾的新型瘤苗聯(lián)合吉西他濱節(jié)拍化療在乳腺癌小鼠模型治療中療效顯著且耐受性良好。

腫瘤疫苗 HMGN1 節(jié)拍化療 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 Foxp3

Department of Breast Oncology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,The National Clinical Research Center

of Cancer;Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy,Tianjin Medical University,Ministry of Education;Tianjin

Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,and Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy,Tianjin,Tianjin

300060,China

This study was supported by the Key Anticancer Technologies R&D Program of Tianjin(No.12ZCDZSY16200),the Scientific

Foundation of Tianjin Health Bureau(No.2010KZ76),and Development Funds for Scientific Projects of Colleges and Universi

ties in Tianjin(No.20100116)

晚期乳腺癌患者常因接受多療程、多方案化療對(duì)多種化療藥物已耐藥，且骨髓儲(chǔ)備功能較差不能耐受常規(guī)劑量化療，是臨床乳腺癌治療的難題。新興的生物治療特別是乳腺癌瘤苗無(wú)疑為晚期乳腺癌患者的治療帶來(lái)了希望，而乳腺癌瘤苗療效受多種因素影響，目前研究熱點(diǎn)主要在如何增強(qiáng)瘤苗免疫療效及克服體內(nèi)抑制因素。警報(bào)素（alarmins）是一類(lèi)具有樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）募集和活化雙重作用的內(nèi)源因子［1］，可作為瘤苗強(qiáng)有力的佐劑，其中高遷移率核小體蛋白1（HMGN1）為alarmins家族中重要成員之一。節(jié)拍性化療（metronomic chemotherapy，MET）是指持續(xù)性、小劑量、高頻率使用細(xì)胞毒性藥物，中間無(wú)間歇期的一種化療方式［2］。Son等［3］研究表明節(jié)拍化療與免疫治療及放療聯(lián)合，顯著提高小鼠結(jié)腸癌生存期，機(jī)制主要是通過(guò)降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平。本研究通過(guò)構(gòu)建HMGN1分泌表達(dá)的乳腺癌瘤苗并聯(lián)合節(jié)拍化療治療小鼠晚期乳腺癌，并初步探討二者協(xié)同作用機(jī)制，為晚期乳腺癌解救治療及乳腺癌生物化療治療模式提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Balb/c小鼠，雌性，4～6周齡，平均體質(zhì)量20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)，符合倫理委員會(huì)認(rèn)可。小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1為本院免疫室保存。吉西他濱購(gòu)自Lilly France公司，F(xiàn)oxp3抗體購(gòu)自Ebioscience公司，CD34抗體購(gòu)自Novus公司，Lipofectamine 2000TM購(gòu)自Invitrogen公司。RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶消化液和青霉素/鏈霉素購(gòu)自Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠乳腺癌瘤苗的制備 利用含HMGN1基因的重組質(zhì)粒，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)狀態(tài)良好的4T1細(xì)胞。24、48 h后采用TCA-丙酮沉淀法提取細(xì)胞上清蛋白，Western blot檢測(cè)HMGN1蛋白的分泌，以分析轉(zhuǎn)染效率。收集分泌量達(dá)到使用標(biāo)準(zhǔn)的4T1細(xì)胞，給予致死量（30 Gy）放射線照射，制備乳腺癌瘤苗。

1.2.2 荷瘤小鼠模型的建立及分組 正常Balb/c小鼠隨機(jī)分成4組，5只/組。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107/mL，接種0.1 mL于每只小鼠右側(cè)腹股溝皮下，每日觀察腫瘤形成情況。捫及腫瘤直徑為6～9 mm時(shí)隨機(jī)分為4組：1）節(jié)拍化療聯(lián)合瘤苗組（聯(lián)合組）：每只小鼠腹腔注射吉西他濱（gemcitabin，GEM）10 mg/kg，每3天1次，持續(xù)至第21天；化療第8天，于腫瘤對(duì)側(cè)皮下注射瘤苗細(xì)胞（1×106個(gè)/只），7 d后加強(qiáng)免疫1次；2）單純瘤苗組（瘤苗組）：只給予瘤苗免疫治療，聯(lián)合組化療7 d后，本組小鼠腫瘤注射瘤苗；3）單純吉西他濱節(jié)拍化療組（MET組）：只給予小劑量吉西他濱治療；4）生理鹽水對(duì)照組（NS組）：采用生理鹽水腹腔內(nèi)和皮下注射。各組用量用法均參照聯(lián)合組。

1.2.3 組織取材及免疫印跡和免疫組織化學(xué)檢測(cè) 上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，在接種腫瘤后第31天，測(cè)量小鼠腫瘤的大小，頸椎脫臼法處死小鼠。無(wú)菌條件下完整剝離瘤組織，生理鹽水沖洗后電子天平稱(chēng)重，將瘤組織切成小塊，部分置于常溫下10%中性福爾馬林浸泡24 h。常規(guī)石蠟包埋后4 μm連續(xù)切片，免疫組織化學(xué)檢測(cè)Foxp3、CD34；另一部分置于液氮中，提取蛋白后Western blot法檢測(cè)Foxp3表達(dá)。

1.2.4 結(jié)果判定 成瘤后隔日測(cè)量小鼠體質(zhì)量和腫瘤最長(zhǎng)徑（a）及與之垂直的橫徑（b），根據(jù)公式V= 1/2ab2計(jì)算移植瘤體積，繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意觀察小鼠皮毛色澤、食欲及活動(dòng)變化。Foxp3判定：Foxp3是Tregs發(fā)育、活化、發(fā)揮功能的關(guān)鍵基因，為叉狀頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞核著色為陽(yáng)性結(jié)果。對(duì)每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野（×400）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值。MVD判定：以CD34單抗作為特異血管內(nèi)皮細(xì)胞表面抗體檢測(cè)MVD，按照Weidner等［4］判定標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGN1基因修飾瘤苗的構(gòu)建

Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染24、48 h后細(xì)胞上清蛋白（各兩個(gè)樣品），結(jié)果顯示均有HMGN1蛋白的分泌（圖1），符合瘤苗構(gòu)建要求。

2.2 各組小鼠乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)

各組小鼠體質(zhì)量、皮毛、食欲、行為等一般情況均未出現(xiàn)與治療有關(guān)的改變。治療前及治療早期各組小鼠皮下移植瘤體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療第13天NS組移植瘤體積與各治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但各治療組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療結(jié)束后，NS組腫瘤體積為（3201.1±657.2）mm3、MET組腫瘤體積為（2010.6± 439.3）mm3、瘤苗組腫瘤體積為（2432.1±527.8）mm3、聯(lián)合組腫瘤體積為（1292.8±364.9）mm3。聯(lián)合組移植瘤體積與NS組比較有顯著性差異（P＜0.001），與MET組或瘤苗組比較亦有顯著性差異（P＜0.05），而MET組和瘤苗組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.209）（圖2）。各組瘤重比較與以上結(jié)果相似（圖3）。

2.3 吉西他濱節(jié)拍化療降低免疫抑制細(xì)胞的檢測(cè)

Western blot結(jié)果顯示，各組小鼠腫瘤組織均表達(dá)Foxp3蛋白，采用蛋白條帶和β-actin的灰度值比值評(píng)價(jià)，MET組及聯(lián)合組比值明顯低于NS組及瘤苗組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示NS組、MET組、瘤苗組、聯(lián)合組小鼠腫瘤組織均能觀察到Foxp3陽(yáng)性淋巴細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別是（40.8±8.3）個(gè)/HP、（13.8±4.4）個(gè)/HP、（34.2±5.1）個(gè)/ HP、（14.4±4.3）個(gè)/HP。分析結(jié)果顯示NS組與含小劑量吉西他濱化療組（MET組及瘤苗組）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），與瘤苗組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.089，圖4～5）。

2.4 節(jié)拍化療對(duì)腫瘤血管新生的影響

MET組（11.4±5.80）與聯(lián)合組（12.8±4.60）的MVD計(jì)數(shù)明顯低于NS組（30.0±3.54）和瘤苗組（24.0± 3.81）（P＜0.001），而兩組間MVD計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.633），NS組和瘤苗組MVD計(jì)數(shù)差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.053）。

3 討論

本研究通過(guò)建立小鼠晚期乳腺癌模型，利用乳腺癌細(xì)胞4T1作為抗原，alarmins家族成員HMGN1作為佐劑構(gòu)建乳腺癌瘤苗，進(jìn)行瘤苗聯(lián)合吉西他濱節(jié)拍化療的聯(lián)合治療，療效顯著且未見(jiàn)明顯毒副反應(yīng)。

alarmins可通過(guò)促進(jìn)抗原的攝取、處理和呈遞，在獲得性免疫預(yù)警過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1，5］。HMGN1作為alarmins家族成員之一在修飾瘤苗方面具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：可刺激DC增殖、成熟；上調(diào)人單核細(xì)胞來(lái)源的DC表達(dá)CD80、CD86、CD83及MHCⅠ/Ⅱ類(lèi)分子等，并促使其分泌lL-12、IL-6、IL-8、IL-23、TNF等促炎性細(xì)胞因子；上調(diào)CCL21、CCR7及下調(diào)CCL5等參與腫瘤免疫反應(yīng)，可進(jìn)一步激活小鼠體內(nèi)免疫效應(yīng)細(xì)胞［6］。利用腫瘤細(xì)胞作為抗原，可避免因腫瘤細(xì)胞抗原表位突變而發(fā)生的免疫逃逸［7］，提供已知和未知的腫瘤相關(guān)抗原，并無(wú)需事先鑒定所有抗原分子。本研究發(fā)現(xiàn)瘤苗組的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)明顯優(yōu)于NS組，這可能與HMGN1較強(qiáng)的免疫佐劑效應(yīng)相關(guān)。

腫瘤疫苗臨床療效欠佳的一個(gè)重要原因是腫瘤獲得了多種逃逸機(jī)體免疫的方法。研究發(fā)現(xiàn)Tregs與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)［8］，腫瘤微環(huán)境中存在的Tregs數(shù)量普遍升高，即腫瘤通過(guò)某種機(jī)制誘導(dǎo)了Tregs的分化，而Tregs可通過(guò)多種途徑抑制機(jī)體的獲得性和天然性抗腫瘤免疫，介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤發(fā)展［9］。逆轉(zhuǎn)Tregs的免疫抑制作用將有助于打破腫瘤免疫耐受，提高腫瘤疫苗的療效。研究表明［10］使用小劑量化療藥物循環(huán)刺激可顯著降低Tregs數(shù)量，小劑量遠(yuǎn)低于臨床常用化療劑量，對(duì)于多次化療后的晚期乳腺癌患者具有重要意義。常規(guī)化療不僅直接殺傷腫瘤細(xì)胞，且抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)，進(jìn)而削弱腫瘤疫苗的免疫治療效果。在化療聯(lián)合免疫治療方面，選擇合適化療藥物劑量［11］和最佳的時(shí)間間隔［12］非常重要。近年來(lái)，MET研究焦點(diǎn)主要是通過(guò)持續(xù)作用于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制其增殖、遷移，阻斷血管生成，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。本研究發(fā)現(xiàn)MET組及聯(lián)合組MVD計(jì)數(shù)明顯低于瘤苗組或NS組，提示MET顯著抑制血管新生，使腫瘤組織缺血壞死，生長(zhǎng)受限，更利于腫瘤疫苗發(fā)揮作用，可能是二者協(xié)同作用的機(jī)制之一。本研究還發(fā)現(xiàn)MET組未見(jiàn)明顯毒副反應(yīng)，表明節(jié)拍化療可用于不能耐受常規(guī)化療的晚期乳腺癌患者。

隨著研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)MET可能是一種多靶點(diǎn)的抗癌手段。Jiang等［13］應(yīng)用紫杉醇MET處理轉(zhuǎn)移性乳腺癌小鼠模型，除抗血管作用外，還具有抗淋巴管生成的作用，推測(cè)MET可能影響腫瘤微環(huán)境。Ghiringheli等［14］研究環(huán)磷酰胺MET能降低荷瘤小鼠體內(nèi)的CD4+CD25+Tregs數(shù)量，改善T細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能，從而起到免疫增強(qiáng)作用。GEM是核苷酸還原酶抑制劑，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成發(fā)揮抗腫瘤作用，被廣泛用于實(shí)體瘤的化療，其不僅直接發(fā)揮抗腫瘤活性，還介導(dǎo)與腫瘤免疫治療相關(guān)的免疫學(xué)效應(yīng)［10，15］，同時(shí)該藥又非常用一線或二線治療藥物，對(duì)于晚期乳腺癌患者意義重大。因此，本研究選用GEM節(jié)拍化療聯(lián)合瘤苗治療，結(jié)果顯示聯(lián)合組小鼠腫瘤生長(zhǎng)較對(duì)照組受到顯著抑制，經(jīng)MET處理的小鼠（MET組及聯(lián)合組）腫瘤局部浸潤(rùn)的Tregs數(shù)量明顯少于NS組及瘤苗組（P＜0.05），表明MET可降低腫瘤局部浸潤(rùn)Tregs數(shù)量，進(jìn)而增強(qiáng)瘤苗療效。

綜上所述，本研究應(yīng)用HMGN1作為免疫佐劑構(gòu)建乳腺癌瘤苗有較好的抗瘤療效，MET通過(guò)降低腫瘤局部浸潤(rùn)的Tregs水平，增強(qiáng)瘤苗特異性免疫效應(yīng)，顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，提示在MET后進(jìn)行瘤苗的主動(dòng)免疫可誘發(fā)較強(qiáng)的腫瘤免疫應(yīng)答，也為打破腫瘤患者免疫耐受狀態(tài)提供了一種新方法。本研究為晚期乳腺癌治療提供了新的選擇，為實(shí)體瘤患者的生物-化療模式提供了一新的思路和方法，值得進(jìn)一步研究。

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（2014-01-16收稿）

（2014-03-26修回）

（本文編輯：張刡）

Anti-tumor effect of tumor vaccine combined with metronomic chemotherapy on breast cancer in mice

Yehui SHI,Liyan ZHOU,Feng WEI,Jinpu YU,Yongsheng JIA,Zhongsheng TONG
Correspondence to:Zhongsheng TONG;E-mail:tonghang@medmail.com

Objective:This study aimed to observe the synergistic effect of a new tumor vaccine combined with metronomic chemotherapy in vivo on breast cancer.This study was also conducted to investigate the mechanism of this combination.Methods:Balb/c mice inoculated with 4T1 mouse breast cancer cell were used as tumor models.High-mobility group nucleosome-binding protein 1 (HMGN1)gene was used to transfect 4T1 cell lines as cancer vaccines.After 4T1 cell was inoculated,the mice were randomized into four groups:normal saline(NS);metronomic gemcitabine(GEM)alone;cancer vaccine alone;and combination therapy group.Tumor growth and potential toxicities of these regimens were observed.The Foxp3 expression of regulatory T cells(Tregs)was detected by western blot and immunohistochemical staining.The microvessel density(MVD)of the tumor was also detected by immunohistochemical staining.Results:The tumor volume of the mice was significantly lower in the combination group than in the MET group or cancer vaccine group(P＜0.05).This result exhibited a higher significant difference than the tumor volume of the mice in the NS group(P＜0.01).Foxp3 expression was significantly lower in the mice treated with GEM(combination or MET group).MVD was significantly lower in these two groups than in the cancer vaccine group or NS group(P＜0.05).Furthermore,adverse reactions slightly occurred in each group.Conclusion:The combination of cancer vaccines and metronomic GEM is a very active and well-tolerated regimen for breast cancer in mice.

cancer vaccine,HMGN1,metronomic chemotherapy,regulatory T cell,Foxp3

10.3969/j.issn.1000-8179.20140125

史業(yè)輝 醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師。研究方向?yàn)槿橄侔┚C合治療。

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺腫瘤內(nèi)科，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，乳腺癌防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市腫瘤免疫與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津市300060）

*本文課題受天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：12ZCDZSY16200），天津市衛(wèi)生局科技基金（編號(hào)：2010KZ76）及天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：20100116）資助

佟仲生 tonghang@medmail.com

E-mail：carfield@medmail.com.cn