鄭玉梅

（吉林省農(nóng)安縣中醫(yī)院檢驗科，吉林 長春130200）

全血法流式細胞術(shù)檢測血小板抗體的效果觀察

鄭玉梅

（吉林省農(nóng)安縣中醫(yī)院檢驗科，吉林 長春130200）

目的探討全血法流式細胞術(shù)檢測血小板抗體的效果，初步建立并優(yōu)化這種以全血為標本的流式細胞儀（FCM）檢測血小板抗體的方法。方法應用FCM，以多種參數(shù)分析全血中的CD61標記的血小板群。結(jié)果采集檢測所需的血樣，其體積以微升為數(shù)量級單位，每次檢測需要2 h，檢測的陽性率與理論值呈明顯正相關(guān)（r＞0.9，P＜0.001），含有CD61抗體的血小板占全部正常血小板的3%，可檢測血小板計數(shù)低達10×109/L的標本。結(jié)論采用全血法流式細胞術(shù)，所需血樣量少，較適合血小板極低或血小板抗體少的患者檢測快速，本法比傳統(tǒng)的定性檢測法與定量檢測法效果好，具有臨床推廣價值。

全血法；流式細胞術(shù)；檢測；血小板抗體；效果觀察

流式細胞儀是一種用于快速測定多量個體細胞特性的儀器，測定前對需要 析的細胞進行熒光標記，壓縮氮讓樣品送入標本室，然后射入光敏感區(qū)，射入速率高達5000～10000個細胞/秒。這時，做好的熒光標記在一定波長的光下被激發(fā)，發(fā)射出熒光脈沖訊號，細胞的數(shù)量與信號的強度成正比。探測器收集儀器中的全血法流式細胞術(shù)和熒光訊號，最終傳入計算機進行分析。傳統(tǒng)方法應用流式細胞術(shù)檢測血小板膜糖蛋白的表達，常用的樣本是經(jīng)洗滌的血小板及富含血小板的血漿。血小板易于被激惹活化，在樣本離心、洗滌等過程中，極易激活體外血小板，影響臨床診斷。因此，我院引進了全血法流式細胞術(shù)?，F(xiàn)將全血法流式細胞術(shù)檢測血小板抗體的效果觀察綜述如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取臨床ITP患者38例，其中輕度15例、中度7例、重度16例。與其年齡段一致的正常對照20例。年齡為23～45歲，平均30.2歲。單克隆抗體（mAb）CD41（GPIIb）PE（Sigma，美國）；10 g/L多聚甲醛；FITC-抗人IgM、FITC-抗人IgG、FITC-抗人IgA、HRP-人IgG（Sigm a，美國）；流式細胞儀ACScan（ Becton-Dick inso，美國）[2]。

1.2 檢查方法

①實驗條件的確立：a.可重復性：首先考察同一實驗操作者在相同實驗條件下，同時對同一樣本進行多次（=5）重復檢測時檢測結(jié)果的重現(xiàn)性；其次考察在相同實驗條件下由不同操作人員同時對同一樣本進行檢測（次數(shù)=5）[3]。b.考察血液標本采集后體外放置時間對FCM檢測血小板抗體的影響：分別在20 ℃下靜置0、2、3、4、6、8、16、24 h后檢測，其他操作步驟相同。c.單克隆抗體劑量的影響：在進行ELISA實驗時，向同一樣本中分別加入CD61單抗5、10、 20 L，進行平行實驗。②FCM檢測：在管中事先涂好肝素，制備得抗凝管。用1 mL針管抽取靜脈血1 mL，注入滅菌后的抗凝管中，9∶1顛倒混勻。在顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)為（20～60）×109/L。操作要迅速，調(diào)整細胞數(shù)后立即向Falcon管中加入5 μL CD41PE mAb 和50 μL血標本并混合均勻。調(diào)整恒溫箱溫度至20 ℃，遮光于暗處孵育20 min。孵育后立即加入2～8 ℃的多聚甲醛固定液，并混合均勻，保持溫度在2～8 ℃放置30 min，等待進行FCM分析，分析要在24 h內(nèi)完成。③ELISA檢測：對分離出的血小板進行洗滌，在顯微鏡下計數(shù)，將血小板溶解，離心后棄去沉淀，取上清液進行ELISA檢測。上清液100 μL，均勻加入96孔酶標板，加入4 mL/LHRP- IgG（酶聯(lián)抗體），用移液槍吹打混勻，置于37 ℃下1 h。將96孔板取出，以洗滌液洗滌四遍后，向每孔加入底物100 μL，置于37 ℃下孵育10 min。取出后立即加入終止劑，在酶標儀洗滌分離出的血小板，計數(shù)后，溶解血小板，離心沉淀，取上清100 μL 加入酶標儀比色皿中。設(shè)置波長為492 nm，讀取比色讀數(shù)，計算含量。

1.3 統(tǒng)計學處理

觀察兩組結(jié)果，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

檢測結(jié)果表明，血小板相關(guān)IgG及PAIgM的熒光強度隨血小板減低程度的升高發(fā)生顯著性升高（P＜0.05）。表明FCM法可用于檢測血小板相關(guān)IgG及PAIgM，進而用于診斷ITG。用ELISA分別檢測正常人、ITP患者血小板PA IgG，檢出率分別為100%和39%，用FCM法，其檢出率則分別為24%、56.52%，EL ISA與FCM 相比，陽性檢測率明顯不足。檢測的陽性率與理論值呈明顯正相關(guān)（r＞0.9，P＜0.001），含有CD61抗體的血小板占全部正常血小板的3%，可檢測血小板計數(shù)低達10×109/L的標本。

3 討 論

經(jīng)過初步研究，我們發(fā)現(xiàn)全血法流式細胞術(shù)在樣品的處理上比傳統(tǒng)方法更為簡單，ELISA法需要多種步驟，處理結(jié)果受人為因素影響較大。FCM能靈敏地從大量正常的血小板中檢出3%含有CD61抗體的血小板，與其真實含量較為接近[4]。因此應用全血法流式細胞術(shù)檢測血小板抗體，對患者的病情診斷具有較大的幫助，且結(jié)果的重復性好，數(shù)據(jù)客觀真實。由于其樣品的前處理步驟變少，對樣品的干擾減小，樣品更接近血漿中的真實生理狀態(tài)。

[1] 鐘明華,廖軍鮮,龍紅,等.流式細胞術(shù)檢測紅細胞相關(guān)抗體及臨床應用[J].中日友好醫(yī)院學報,2010,15(1):3-6.

[2] 李珉珉.流式細胞術(shù)檢測血小板功能及其臨床應用[J].中華醫(yī)學檢驗雜志,2010,22(3):182-184.

[3] 徐成偉,盧鑫,陳穎潔,等.慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜患者PAIgG、ACA IgG 的測定及意義[J].山東醫(yī)藥,2010,42(16):12-13.

[4] 余暉,高曉陽.全血法流式細胞術(shù)檢測血小板相關(guān)抗體[J].細胞與分子免疫學雜志,2010,26(12):1296-1298.

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1671-8194（2014）21-0245-01