王競濤，龔記葉，黃志遠，郝連偉，錢晶晶，李海霞，王 忠

清開靈由清代吳鞠通《溫病條辨》名方安宮牛黃丸化裁而來[1]，主要成分包括牛黃、水牛角、黃芩、金銀花、梔子等，具有清熱解毒、化痰通絡(luò)、醒神開竅的功能，對中風和其他如意識障礙、失語、高熱等癥狀有肯定的療效[2-3]。由黃芩苷、梔子苷、膽酸、珍珠母等有效成分組成的精制清開靈注射液在減輕腦水腫、蘇醒意識、降低病死率等方面療效顯著[4]?；A(chǔ)研究亦顯示其有良好的降低毛細血管通透性、減輕細胞中毒水腫、阻止損害范圍擴大和減少神經(jīng)元死亡等作用，實質(zhì)是對中風腦缺血級聯(lián)反應(yīng)病理過程的整體綜合調(diào)節(jié)作用。目前的研究表明，精制清開靈組分及配伍發(fā)揮藥效作用的共同機制主要為抗凋亡和神經(jīng)保護，通過多通路調(diào)控腦缺血的病理生理過程，如凋亡、代謝過程、信號轉(zhuǎn)導、生長、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)等，并且具有多樣性的藥效作用機制。現(xiàn)就黃芩苷、梔子苷及其配伍對于腦血管疾病的治療機制研究進展綜述如下。

1 黃芩苷

1.1 對缺血缺氧后能量代謝的影響 有研究發(fā)現(xiàn)，黃芩提取物能減少缺氧狀態(tài)下腦線粒體能量的消耗，減少琥珀酸氧化的限制和保護線粒體膜的完整性[5]。李偉華等[6]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可抑制缺氧缺糖/再灌注導致的線粒體損傷，保護線粒體的活性；并且10 mmol/L的黃芩素和黃芩苷就能有效抑制維生素C中的Fe2+、水溶性偶氮引發(fā)劑2，2-偶氮二(2-瞇基丙烷)鹽酸鹽及N-乙酰-1，6-二氨基乙酸(NADAH)誘導的鼠大腦皮質(zhì)線粒體的脂質(zhì)過氧化作用[7-8]。在大腦中動脈阻塞(MCAO)大鼠模型再灌注實驗中，楊養(yǎng)賢等[9]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷能增高大鼠腦內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)含量，降低脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量，縮小梗死面積，顯示黃芩苷對腦缺血再灌注自由基損傷有一定保護作用；熊娟等[10]亦發(fā)現(xiàn)黃芩苷能降低腦內(nèi)MDA含量，增強SOD活性，同時能降低一氧化氮(NO)含量；除此之外，陳忻等[11]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷還能升高谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)含量，降低MCAO模型大鼠的神經(jīng)功能缺損評分。陳科達等[12]在小鼠腦片和大鼠神經(jīng)元缺氧缺糖/再灌注損傷的模型中，亦證實黃芩苷能顯著降低神經(jīng)元內(nèi)乳酸脫氫酶水平。宋元宗等[13]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能夠拮抗過氧化氫(H2O2)所致的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞氧化損傷。綜上所述，黃芩苷減緩了缺血缺氧后的能量代謝障礙。

1.2 對缺血缺氧后細胞凋亡的干預 國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對海人酸所致神經(jīng)毒性有抑制效應(yīng)[5]；黃芩苷預處理對百日咳菌所致的神經(jīng)元損害具有保護作用，其保護作用可能與黃芩苷能減少谷氨酸和H2O2對離體神經(jīng)元的損害作用有關(guān)[14]；黃芩苷還能影響大鼠神經(jīng)元內(nèi)Ca2+釋放和細胞外Ca2+內(nèi)流，有效保護神經(jīng)元免受興奮性毒性作用[15]；此外，黃芩苷既可以促進熱休克蛋白(HSP70)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，也可以通過抑制caspase-3表達降低凋亡率[16-18]。陳群等[19]采用沙土鼠前腦缺血模型證實，黃芩苷能夠抑制腦缺血后微管運動蛋白免疫活性下降，減少海馬CAI區(qū)錐體細胞延遲性死亡，從而達到腦保護的作用。另有實驗發(fā)現(xiàn)，黃芩苷等清開靈有效組分可使腦組織神經(jīng)生長因子(NGF)含量升高，推測在黃芩苷等清開靈有效組分對腦缺血損傷神經(jīng)元的保護作用中，促進天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等產(chǎn)生NGF可能是其主要途徑[20]。

1.3 對缺血缺氧后腦組織的保護作用 實驗研究顯示，黃芩苷能抑制缺血12 h和24 h血漿血栓素B2(TXB2)的表達；在缺血12 h抑制血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)釋放，但在缺血24 h可升高血漿vWF水平；并可升高缺血12 h血漿6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)水平，降低缺血12 h TXB2/6-keto-PGF1α比值[20]。高永紅等[21]采用氧糖剝奪法對體外培養(yǎng)的大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞模擬缺血再灌注損傷，結(jié)果顯示黃芩苷能顯著降低基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)mRNA的表達。實驗研究證實了黃芩苷對大鼠百日咳致腦水腫具有保護作用[22]，這種作用與抑制鐵依賴脂質(zhì)過氧化、螯合腦組織Fe2+及激活腦組織中Cu、Zn-SOD的活性有關(guān)。陳光福[23]應(yīng)用兔感染性腦水腫模型進行實驗，發(fā)現(xiàn)黃芩苷可抑制磷脂酶A2(PLA2)活性和脂質(zhì)過氧化，從而減輕腦水腫、降低顱內(nèi)壓。李玉飛等[24]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可減輕單純抗生素治療所致腦組織水腫、Na及Ca含量的增加，從而減輕腦膜的炎性反應(yīng)、腦腫脹和腦細胞的損傷，并降低細菌性腦膜炎時腦組織勻漿中白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和NO含量。提示黃芩苷通過抑制Ca2+內(nèi)流，減少IL-1β、TNF-α含量和NO分泌，從而起到保護腦組織作用，減輕繼發(fā)性腦損傷為其可能的機制之一。近年研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可抑制感染性腦水腫大鼠腦組織的TNF-α、IL-1β的過度產(chǎn)生，減輕腦組織水腫，據(jù)推測其作用機制可能與抑制核因子κB(NF-κB)的異?；罨嘘P(guān)[25]。楊養(yǎng)賢等[26]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷同樣也能降低腦缺血-再灌注后TNF-α、IL-1β的表達，具有一定的腦組織保護作用。

1.4 對炎性因子的調(diào)節(jié) 缺血后的炎性反應(yīng)是繼發(fā)性腦損傷的重要原因之一。炎性因子的表達與自由基的刺激有關(guān)，將產(chǎn)生一系列反應(yīng)，造成血管源性腦水腫、微循環(huán)障礙等。炎癥的發(fā)生機制很復雜，黏附因子和細胞因子在炎癥發(fā)展過程中作用重大，可見，抑制其表達是控制炎性反應(yīng)的關(guān)鍵。黃芩苷具有顯著的抗炎作用，其作用機制主要是干擾前列腺素和花生四烯酸的代謝[27-28]。

有研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷及其銅、鋅配合物(GuB2、ZnB2)對超氧自由基(O2-)具有明顯的清除作用，并呈量效關(guān)系[29]。周峻偉[30]采用大鼠MCAO模型，測定出黃芩苷能降低缺血再灌注24 h缺血部位腦組織中單核細胞趨化因子-1(MCP-1)的表達，進而減少小膠質(zhì)細胞活化和單核巨噬細胞在損傷部位積聚，但是對缺血12 h的MCP-1無顯著性降低作用。Tu等[31]在MCAO大鼠永久性缺血24 h后，用RC-PCR檢測患側(cè)腦組織，發(fā)現(xiàn)黃芩苷能減少環(huán)氧化酶-2(COX-2)、過氧化物酶(MPO)的表達。歐陽昌漢等[32]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能顯著抑制細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、誘導型一氧化氮合酶(iNoS)和NF-κB表達，降低缺血皮質(zhì)白介素1(IL-1)含量和大鼠短暫性腦缺血后皮質(zhì)梗死體積，改善神經(jīng)功能狀態(tài)。徐雅等[33]采用大鼠MCAO模型證實黃芩苷在缺血12 h能刺激可溶性腫瘤壞死因子受體(sTNF-R)的分泌，缺血24 h能降低TNF-α的含量，但在缺血12 h對TNF-α的含量無顯著影響及在缺血24 h對sTNF-R的分泌無影響，說明黃芩苷對TNF-α及sTNF-R的作用具有時效性。高中洪等[34]運用電子自旋共振(ESR)檢測，結(jié)果顯示黃芩素和黃芩苷可清除羥自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和烷基，并呈劑量依賴關(guān)系。張羅修等[35]報道了黃芩苷對刺激鈣離子載體A23187誘導大鼠腹腔巨噬細胞前列腺素E2(PGE2)的合成有抑制作用。杜肇宗等[36]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可選擇地抑制脂加氧酶而達到抗炎作用。從黃芩莖葉中提取分離的總黃酮能明顯抑制由組織型纖溶酶原激活物(t-PA)、冰醋酸和二甲苯所引起的急性滲出性炎癥，對慢性組織增生炎癥亦有明顯的治療作用，其作用機制是通過抑制iNoS，減少毛細血管內(nèi)皮細胞釋放NO，調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝，抑制PGE2和白三烯的合成[37]。

1.5 其他 在分子水平上，黃芩苷具有DNA結(jié)合、核苷酸結(jié)合、轉(zhuǎn)錄酶和信號轉(zhuǎn)導激活的功能，能夠阻斷平滑肌細胞膜上的電壓依賴型鈣通道和受體操縱型鈣通道而抑制細胞[Ca2+]i的增高，這可能與缺血后DNA、核苷酸等功能修復有關(guān)[38-39]。研究表明，黃芩苷能激活海馬神經(jīng)元神經(jīng)生存通路PI3K-Akt-PKB-BAD-CREB-PCREB的信號轉(zhuǎn)導[40]，促進星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)性增生[41]，上調(diào)腦組織轉(zhuǎn)化生長因子β表達[42-43]，抑制細胞內(nèi)鈣超載引起的5-脂氧合酶(5-Lox)轉(zhuǎn)位表達，從而減少半胱氨酸白三烯(cys-LT)的合成，減輕血-腦脊液屏障的破壞[44]。通過分析黃芩苷對缺血再灌注大鼠模型基因的影響，發(fā)現(xiàn)在眾多基因中有的基因表達上調(diào)，有的基因表達下調(diào)，說明黃芩苷是多基因、多途徑發(fā)揮腦保護作用[45]。具體如黃芩苷通過激活或者抑制具有ATP結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子激活、轉(zhuǎn)錄酶等功能的差異基因來發(fā)揮腦保護作用，如激活Camk2b、Map2k1(MEK1/2)、Map2k6(MKK3/6)、Map3k4(MEKK)從而激活促性腺激素釋放激素(GNRH)信號通路；抑制CDC42從而抑制cJun氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase，JNK)；抑制CDC42、catnb(β-catenin)、Pxn(paxillin)和Rock1從而抑制焦點粘連過程[46]。

2 梔子苷

梔子苷的既往藥理研究表明其有抗炎和抗凝血活性[47-48]，并具有解毒、抗氧化、抗腫瘤作用[49]。在神經(jīng)藥理研究中，梔子苷具有神經(jīng)營養(yǎng)、誘導神經(jīng)元分化作用[50]。

2.1 對神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響 鄭加嘉等[42]認為，促進星形膠質(zhì)細胞等產(chǎn)生堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)是梔子苷對腦缺血損傷神經(jīng)元起保護作用的主要途徑。桅子提取物可用于改善缺血再灌注大鼠損傷后神經(jīng)功能缺損癥狀[51]。桅子可顯著提高缺血再灌注24 h和72 h兩個時段的腦組織NGF水平，說明桅子具有較為持久的激發(fā)NGF的神經(jīng)元保護作用[52]。張小燕等[53]認為梔子苷上調(diào)鈣結(jié)合蛋白表達，說明梔子苷對缺血性腦神經(jīng)損傷具有一定的保護作用。有實驗發(fā)現(xiàn)，梔子苷對炎性細胞因子TNF-α和IL-1β表達有明顯的抑制作用，可減輕腦缺血損傷，對神經(jīng)元起到保護作用[54]。

2.2 參與缺血缺氧后抗氧化反應(yīng) 實驗研究發(fā)現(xiàn)，梔子苷可抑制缺氧缺糖/再灌注導致的線粒體損傷、保護線粒體的活性[6]。在腦缺血后，梔子苷進一步上調(diào)GSH-Px的表達，說明梔子苷對缺血性腦神經(jīng)損傷中的自由基損傷具有很好的拮抗作用[53]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)梔子苷通過激動胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)等而誘導細胞中血紅素加氧酶(HO-1)水平上調(diào)，提高細胞對氧化劑5-氨基-3-(4-嗎啉基)-1，2，3-惡二唑鹽酸鹽(SIN-1)氧化損傷的抵抗力，使細胞免受其傷害[55]。

2.3 在炎性反應(yīng)中的作用 梔子苷可以顯著降低缺血腦組織的MCP-1含量[26]，并可阻抑腦缺血損傷后致炎因子TNF-α、IL-1β及血漿vWF的表達，顯示出其抗缺血后血管內(nèi)皮細胞損傷、在炎癥病理環(huán)節(jié)阻抑腦缺血損傷級聯(lián)反應(yīng)的作用[56]；但對血清神經(jīng)元特異烯醇化酶(NSE)含量的影響不顯著[54]。這種現(xiàn)象顯示出了單一藥物對應(yīng)的單一環(huán)節(jié)在治療腦缺血損傷中的局限性，由此在將來的研究中更需要注重中藥復方及其多環(huán)節(jié)治療作用。梔子苷在腦缺血24 h可有效抑制不同時段內(nèi)皮素-1(ET-1)的增加趨勢，阻斷缺血12 h MCAO大鼠血漿TXB2高表達，可升高血漿vWF[57]。

2.4 對黏附因子的調(diào)節(jié)作用 研究發(fā)現(xiàn)，梔子苷的作用主要體現(xiàn)在對黏附分子——ICAM-1、血管細胞黏附因子-1(VCAM-1)有非常顯著的降低作用，對MMP-9無明顯作用[58]。Hayashi等[59]研究發(fā)現(xiàn)，梔子果實提取物有促進內(nèi)皮細胞增殖與修復的作用。梔子苷可顯著降低腦缺血后腦組織中ICAM-1和內(nèi)皮選擇素(E-selectin)的表達[60]。實驗結(jié)果顯示，梔子苷可通過下調(diào)NF-κB /IκB 信號通路的活性，減少VCAM-1和E-selectin的生成，降低細胞黏附分子(CAMs)對血管的黏附作用[55]。梔子苷通過抑制Pou3f1抑制巨細胞變異，調(diào)節(jié)鳥苷三磷酸酶(GTP酶)和血管發(fā)育等功能[38-39]。

3 黃芩苷與梔子苷相使配伍

黃芩苷與梔子苷的重疊基因功能類似，都與蛋白氨基酸磷酸化、鈣離子調(diào)控、細胞凋亡和變異等功能相關(guān)[38-39]。黃芩苷與梔子苷重疊基因通過抑制谷氨酸轉(zhuǎn)移保護大腦損傷，調(diào)控細胞凋亡；通過激活ErBb信號通路的下游基因CAMK、MEX、BAD，從而激活ErBb信號通路[46]。在其共同信號通路中，通過刺激Bad和map2kl1(mek)激活血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路來促進細胞增殖和存活，通過抑制CDC42、mapkapk2、pxn(paxillin)從而抑制焦點黏附和細胞遷移。

3.1 抗氧化作用 在采用線拴法建立的大鼠腦動脈缺血再灌注模型實驗中，超微組織觀察(TEM)顯示線粒體結(jié)構(gòu)完整[40]，說明黃芩苷與梔子苷配伍可抑制缺氧缺糖/再灌注導致的線粒體損傷、保護線粒體的活性；并可顯著提高腦組織抗氧化酶如SOD、GSH-Px的活性，降低腦組織MDA和血漿vWF含量，呈現(xiàn)出明顯的協(xié)同增效作用[51]，從而減緩了缺血缺氧后的能量代謝障礙，有較好的抗氧化作用。

3.2 調(diào)控炎性反應(yīng) 荊志偉等[61]用主要成分分析探索不同中藥組分配伍干預腦缺血的基因表達模式，發(fā)現(xiàn)黃芩苷、梔子苷及其配伍均能有效干預細胞黏附相關(guān)基因，配伍后對細胞黏附相關(guān)基因干預作用優(yōu)于單一組分組，起到加和效應(yīng)的主要貢獻基因集中在整合素家族基因，如Itgam、Itga4、Pkp1、Itga2、Itgb6、Itga3等，且黃芩苷和梔子苷均共同調(diào)控了Tnfsf5、Itga3、Itgam、Itga2等基因。因此，清開靈有效組分及其配伍可能是通過干預腦缺血后炎性反應(yīng)來發(fā)揮腦保護作用的。周峻偉[30]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷、梔子苷可以顯著降低缺血腦組織的MCP-1含量，推測其保護作用可能與通過降低缺血部位腦組織中MCP-1的表達，進而減少小膠質(zhì)細胞活化和單核巨噬細胞在損傷部位積聚等有關(guān)。黃芩苷、梔子苷配伍可能通過降低缺血腦組織中半胱氨酰白三烯受體(CysLT2)蛋白及mRNA表達，從而降低腦缺血炎性反應(yīng)，對腦缺血起到一定的保護作用，其對CysLT2 受體蛋白表達影響最為明顯，具體作用機制還需進一步研究[62]。實驗發(fā)現(xiàn)，黃芩苷、梔子苷配伍能顯著降低腦缺血大鼠血清中TNF-α、IL-1β和白介素10(IL-10)含量，具有確切的腦缺血保護作用，由此推測其作用機制是通過降低腦缺血時炎性因子含量以實現(xiàn)腦保護作用。

3.3 神經(jīng)保護作用 黃芩苷、梔子苷對腦缺血損傷神經(jīng)元的保護作用，以顯著降低缺血腦組織的MCP-1及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)含量，促進星形膠質(zhì)細胞等產(chǎn)生bFGF和生成NGF為主要途徑[41-42，53，63]，與激活PI3K-Akt-PKB-BAD-CREB-PCREB 途徑密切相關(guān)[40，42]。

有研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷、梔子苷能顯著降低腦缺血后腦組織BDNF的含量[42]，表明其具有穩(wěn)定缺血損傷神經(jīng)元代謝的作用，這對于在低氧環(huán)境下神經(jīng)元的存活具有重要的生物學意義。Zhang等[64]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷與梔子苷配伍后對腦缺血大鼠的保護作用增強，這與其對BDNF和caspase-3的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。嚴華等[63]研究發(fā)現(xiàn)，清開靈總方及黃芩苷、梔子苷可提高缺血損傷后NGF的分泌量，由此推測清開靈治療中風的機制在于清開靈總方及有效成分黃芩苷、梔子苷可上調(diào)缺血損傷導致的神經(jīng)膠質(zhì)細胞分泌的NGF的量，同時提示組成清開靈的多種有效成分作用的分子靶點存在差異，為中藥方劑配伍原理提供實驗依據(jù)。

4 小結(jié)

總之，清開靈有效組分黃芩苷與梔子苷治療腦血管病的機制是一個復雜而多樣的變化過程：黃芩苷具有清除自由基、增強抗氧化酶活性、保護線粒體等抗氧化作用；在神經(jīng)保護作用上，能夠有效抑制鈣超載、促進NGF的生成；并且時效性作用于TXB2的表達，減少IL-β及TNF-α含量，抑制NO分泌，從而實現(xiàn)腦保護的作用；在抗炎方面，其作用機制主要是抑制前列腺素和花生四烯酸等黏附因子和細胞因子的表達。梔子苷具有抗炎、抗氧化及神經(jīng)保護等作用，機制與黃芩苷類似。

黃芩苷與梔子苷配伍使用則呈現(xiàn)出明顯的協(xié)同增效作用，例如可顯著提高腦組織SOD活性，降低腦組織MDA和血漿vWF含量等。黃芩苷與梔子苷都有調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的功能，而這些蛋白大都與促進腦損傷恢復相關(guān)；都有ATP結(jié)合功能，通過調(diào)節(jié)腦缺血后ATP酶活性降低所引起的一系列病理生理反應(yīng)，從而減輕腦損傷[65]，這可能是清開靈有效組分發(fā)揮腦缺血保護機制中的重要方面之一；均通過調(diào)控不同的蛋白激酶發(fā)揮對腦缺血的干預，所以推測黃芩苷、梔子苷發(fā)揮藥效作用與蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化過程密切相關(guān)[65]。

綜上所述，單一使用黃芩苷或梔子苷治療腦血管疾病療效肯定，其作用機制的共性及多樣性、針對性使其配伍應(yīng)用療效更優(yōu)，充分體現(xiàn)了中醫(yī)藥多組分、多途徑、多靶點的整和調(diào)節(jié)的優(yōu)勢與特點，比傳統(tǒng)飲片作用更直接，療效更顯著，使用更方便，不良反應(yīng)發(fā)生率更小。當然，目前的研究還有許多的不足：黃芩苷與梔子苷配伍使用呈現(xiàn)的協(xié)同增效作用，其根本機制以及其中的基因之間的相互聯(lián)系、相互作用等有待進一步研究，這將有助于提高其他有效組分的治療效果，從深層次上揭示清開靈有效組分干預作用的實質(zhì)，使之更好地服務(wù)于臨床。

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