林海平 王 永 沈 燕 王 舒

(天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 300073)

腦缺血再灌注損傷(CIRI)是指腦缺血一定時(shí)間再恢復(fù)血液供應(yīng)后，大腦功能不僅沒(méi)有得到及時(shí)恢復(fù)，反而出現(xiàn)更加嚴(yán)重的功能活動(dòng)障礙。缺血再灌注損傷是一種常見(jiàn)、復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其主要的損傷形式是細(xì)胞凋亡(apoptosis)。細(xì)胞凋亡是指在一定的生理和病理?xiàng)l件下，機(jī)體為了維護(hù)內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定，通過(guò)多基因的調(diào)控使細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程，屬于一種生理性的細(xì)胞死亡。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的很多學(xué)者從多種角度研究腦缺血再灌注后的細(xì)胞凋亡機(jī)制，發(fā)現(xiàn)多種因素參與細(xì)胞凋亡。目前研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡主要存在兩種途徑：細(xì)胞外的死亡受體途徑和細(xì)胞內(nèi)的線粒體途徑。在缺血性腦血管病中，神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡與壞死一樣，對(duì)神經(jīng)元的功能損害具有重要作用〔1〕。細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在缺血程度較輕的半暗影區(qū)，是一種涉及多因素調(diào)控的復(fù)雜的主動(dòng)死亡過(guò)程，其中主要包括：Caspase-3、NF-κB、Bcl-2/Bax等因子的調(diào)控。

1 Caspase-3與細(xì)胞凋亡

1.1Caspase家族 Caspase家族是一大類凋亡調(diào)控因子，最初有學(xué)者發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)屬動(dòng)物的細(xì)胞凋亡需要一種名為CED-3的蛋白，這種蛋白和哺乳動(dòng)物白細(xì)胞介素-1轉(zhuǎn)換酶(ICE)是同源物，因它們均特異性地在P1位點(diǎn)的天冬氨酸殘基后切割底物，所以命名為Caspase。按其分子結(jié)構(gòu)可將Caspase家族分為3大類：I類是ICE亞家族，作用于四肽序列WEHD，主要包括Caspase-1、4、5、11和13；Ⅱ類是CPP32亞家族，最易識(shí)別DEXD序列，包括Caspase-2、3、7和10；Ⅲ類是ICE-1亞家族，作用于EXD序列，包括Caspase-6、8和9；其后兩類在細(xì)胞凋亡中起重要作用〔2，3〕。

1.2Caspase-3的激活及對(duì)細(xì)胞凋亡的作用 在Caspase家族中，Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)“瀑布下游”最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶,其在正常細(xì)胞(包括神經(jīng)細(xì)胞)中以酶原形式存在，受凋亡刺激因素作用后激活，參與腦缺血再灌注后神經(jīng)元損傷的病理過(guò)程，引起細(xì)胞凋亡。研究證明Caspase-3在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后樞紐作用〔4〕，是細(xì)胞凋亡的重要執(zhí)行者和哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，被稱作是“殺手蛋白”。

研究表明Caspase-3主要通過(guò)細(xì)胞凋亡的線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔5～7〕。(1)線粒體通路：當(dāng)缺血再灌注造成線粒體損傷后，細(xì)胞色素C(Cyt-C)作為應(yīng)激傳感器從線粒體中被誘導(dǎo)釋放到胞質(zhì)中，在ATP/dATP存在的情況下，Cyt -c能與凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)結(jié)合，使Apaf-1構(gòu)象發(fā)生改變繼而寡聚化，接著和procaspase-9 結(jié)合形成“凋亡體”，從而激活Caspase-9，活化的Caspase-9又進(jìn)一步激活下游的Caspase-3等，完成其相應(yīng)底物的剪切，引起細(xì)胞凋亡〔8〕。(2)死亡受體通路：腫瘤壞死因子超家族的死亡配體TNF-α和細(xì)胞表面的死亡受體FasL/CD95L相結(jié)合，使受體三聚化，然后通過(guò)DD(death domain)域募集銜接蛋白(如FADD)，銜接蛋白通過(guò)死亡效應(yīng)域(DED)與procaspase-8 形成一個(gè)超分子復(fù)合物(死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物)，然后激活Caspase-8，進(jìn)而啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游的Caspase-3等，引起細(xì)胞凋亡。(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中由于鈣平衡的破壞和自由基蓄積引起其壓力的改變，誘導(dǎo)Caspase-12(位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜)的表達(dá)，進(jìn)而激活下游的Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡。關(guān)于Caspase-3與腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的具體作用機(jī)制，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，激活后的Caspase-3可裂解細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶類,破壞細(xì)胞骨架和核骨架，改變細(xì)胞形態(tài)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者都通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：大鼠腦缺血再灌注后Caspase-3表達(dá)明顯增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞明顯增加，二者之間存在明顯的時(shí)空相關(guān)性〔9，10〕；而通過(guò)向大鼠腦室內(nèi)注射Caspase-3抑制劑z-DEVD-fmk后，發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)細(xì)胞凋亡的數(shù)量明顯減少〔11〕。這些研究均證明了腦缺血再灌注后Caspase-3的表達(dá)及其與腦缺血損傷的密切關(guān)系：在腦缺再灌注損傷的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，Caspase-3作為下游凋亡效應(yīng)因子起著關(guān)鍵性作用。

2 核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)與細(xì)胞凋亡

2.1NF-κB NF-κB首先是由Rwiansen在1986年發(fā)現(xiàn)的。他在成熟B細(xì)胞和漿細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白，能與免疫球蛋白κ輕鏈內(nèi)含增強(qiáng)子的特異性序列結(jié)合，該序列由10個(gè)核苷酸組成(5-GGGACTTTCC-3)，故命名為κB，是一種廣泛存在于神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子〔12〕。其家族成員在氨基末端部位均含有一段大約300個(gè)氨基酸所組成的保守區(qū)，被稱為Rel同源結(jié)構(gòu)域，包含有DNA結(jié)合區(qū)、二聚體形成區(qū)、核定位信號(hào)(NLS)、前激肽釋放酶激活劑(PKA)磷酸化區(qū)域。根據(jù)C-末端的不同，可以將NF-κB家族成員分為兩組：第一組包括P50和P52，分別由其蛋白前體P105和Pl00裂解而來(lái)；第二組包括沒(méi)有前體的P65/RelA 、RelB 和c-Rel，其中發(fā)揮主要生理功能的是由P50-P65所形成的異源二聚體，即我們通常所指的NF-κB。

2.2NF-κB的激活及對(duì)細(xì)胞凋亡的作用 在靜息狀態(tài)下，NF-κB家族形成的二聚體與IκB-α(NF-κB的抑制蛋白)以三聚體的形式存在于胞質(zhì)中，此時(shí)的NF-κB不具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的能力〔13〕，當(dāng)受到激活的蛋白激酶刺激時(shí)，IκB-α發(fā)生磷酸化,磷酸化后的IκB-α使NF-κB游離于胞漿中，迅速發(fā)生核移位，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1、細(xì)胞間黏附分子、腫瘤壞死因子-α等的表達(dá)和鈣超載、氧自由基的形成，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控〔14，15〕，這是NF-κB主要激活途徑。此外，酪蛋白激酶2(CK2) 激活后引起IκB-α的C端磷酸化，從而使NF-κB的激活不依賴IκB，而是通過(guò)p38絲裂原活化蛋白激酶，因此p38-CK2-IκB-α也是激活NF-κB的途徑之一〔16〕。

NF-κB對(duì)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制主要體現(xiàn)在通過(guò)調(diào)控一系列凋亡相關(guān)因子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。有研究認(rèn)為腦缺血再灌注可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基形成等，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而激活NF-κB，活化后的NF-κB則誘導(dǎo)凋亡基因(如TRAIL-1和TRAIL-2 死亡受體)表達(dá)上調(diào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔17〕；而NF-κB的活化還可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制蛋白c-IAP1和c-IAP2的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放，進(jìn)而阻止Caspase-3，7，9的活化而抑制細(xì)胞凋亡。NF-κB還可以通過(guò)對(duì)其自我吞噬作用的抑制來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用〔18〕。Nijboer等〔19〕則認(rèn)為NF-κB在細(xì)胞凋亡中起雙重作用，早期NF-κB的激活加重腦損傷，而NF-κB的持續(xù)激活則能產(chǎn)生內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子，上調(diào)抗凋亡因子的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。Crack等〔20〕認(rèn)為NF-κB對(duì)細(xì)胞凋亡起促進(jìn)還是抑制作用主要和NF-κB的產(chǎn)生部位、刺激信號(hào)、產(chǎn)生量以及持續(xù)時(shí)間有關(guān)。

NF-κB在細(xì)胞凋亡中究竟起何種作用，目前還沒(méi)有定論。Peter等〔21〕在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后，與野生型老鼠比較，抗氧化劑Gpx1敲除鼠的NF-κB表達(dá)含量顯著增加，腦缺血損傷范圍明顯擴(kuò)大，大腦皮層和紋狀體區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量也相應(yīng)增加，由此推斷腦缺血再灌注后腦區(qū)的超氧化狀態(tài)引起NF-κB的過(guò)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。通過(guò)抑制IκB-α的降解及磷酸化可以顯著降低NF-κB的活性，從而減輕缺血再灌注所引起的腦組織損傷〔22〕；而Hill等〔23〕在大鼠腦缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)NF-κB對(duì)細(xì)胞凋亡起抑制作用。因此NF-κB對(duì)細(xì)胞凋亡的具體作用還有待進(jìn)一步的研究。

3 Bcl-2/Bax與細(xì)胞凋亡

3.1Bcl-2家族蛋白 Bcl-2作為目前首個(gè)被確認(rèn)有抑制細(xì)胞凋亡作用的因子〔24〕，近些年成為腦缺血再灌注損傷的研究熱點(diǎn)之一，其家族成員之間的相互作用對(duì)腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡起了重要的調(diào)節(jié)作用。

按其結(jié)構(gòu)和對(duì)細(xì)胞凋亡的不同作用可將Bcl-2家族分為兩大類：一類為抗凋亡蛋白，主要包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等；另一類為促凋亡蛋白，主要包括Bax、Bak、Bid等。其中Bcl-2和Bax作為Bcl-2家族蛋白的最主要成員，其表達(dá)的變化對(duì)細(xì)胞凋亡起重要的調(diào)節(jié)作用〔25〕。Bcl-2由239個(gè)氨基酸組成，主要位于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜等處，Bax是一種跨膜蛋白，主要存在于細(xì)胞內(nèi)膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，與Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的作用正好相反，Bax作為Bcl-2家族中最重要的促細(xì)胞凋亡因子，能與Bcl-2形成異源二聚體，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

3.2Bcl-2/Bax的激活及對(duì)細(xì)胞凋亡的作用 Bcl-2和Bax作為一組重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，二者在正常狀態(tài)下構(gòu)成一個(gè)平衡體系。當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激因素作用后，他們的表達(dá)就會(huì)發(fā)生變化，二者的比值決定了細(xì)胞是否凋亡：當(dāng)Bcl-2表達(dá)占優(yōu)時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，Bax表達(dá)占優(yōu)時(shí)則促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔26〕。當(dāng)受到凋亡刺激時(shí)，Bcl-2與其他家族成員如Bax等通過(guò)磷酸化、蛋白水解等方式，最終定位于線粒體膜，通過(guò)調(diào)節(jié)膜的通透性〔27〕，使得Bcl-2能在線粒體膜上通過(guò)多種途徑抑制細(xì)胞凋亡：(1)Bcl-2蛋白作為線粒體PT孔道的有效組成成分，其高表達(dá)后可以阻止Cyt-c等穿過(guò)線粒體膜，進(jìn)而阻止由Cyt-c所引起的凋亡程序(Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng))〔28〕，抑制細(xì)胞凋亡。(2)Bcl-2高表達(dá)后可以阻止bax/bak的寡聚化，從而抑制Cyt-c和AIF(凋亡介導(dǎo)因子)等重要蛋白的釋放，使細(xì)胞免于凋亡〔29〕。(3)Bcl-2還可以調(diào)節(jié)線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)，控制其膜電位，阻斷氧化作用對(duì)細(xì)胞的破壞，改變鈣離子分布，從而激活內(nèi)源性內(nèi)切酶，抑制谷胱甘肽(GSH)的外移以降低胞內(nèi)的氧化還原電位，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。此外，Bcl-2還可以將凋亡蛋白前體Apaf-1等定位至線粒體膜上，使其不能發(fā)揮凋亡作用從而保護(hù)細(xì)胞。而 Bax當(dāng)受到凋亡刺激后，由胞質(zhì)向線粒體外膜轉(zhuǎn)位，與膜上的電壓依賴性離子通道結(jié)合， 拮抗Bcl-2對(duì)線粒體通透性的抑制作用，從而開(kāi)放線粒體通透轉(zhuǎn)換孔(MPT)，最終啟動(dòng)Caspase相關(guān)的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔30〕。綜上所述，Bcl-2/Bax主要通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，二者通過(guò)在線粒體外膜形成離子通道，阻止或促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而調(diào)節(jié)一系列凋亡因子，完成對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。Hetz〔31〕通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后，Bcl-2和Bax之間的平衡狀態(tài)被打破，二者表達(dá)的比率決定了腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡與否：當(dāng)Bcl-2過(guò)表達(dá)時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，相反則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且還發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制Bax通道活性可以降低缺血再灌注后的細(xì)胞凋亡。近期國(guó)內(nèi)外研究同樣證實(shí)了Bcl-2和Bax對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，與之前的大量研究結(jié)果相似：Bcl-2對(duì)于腦缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的抑制作用十分明顯，其與Bax之間的相互作用以及二者之間表達(dá)比值的變化共同決定細(xì)胞凋亡與否〔32，33〕。

4 結(jié) 語(yǔ)

腦缺血再灌注損傷是一種機(jī)制復(fù)雜而又臨床常見(jiàn)的病理生理過(guò)程，細(xì)胞凋亡是其嚴(yán)重的損傷形式之一。有學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞凋亡是涉及多種凋亡相關(guān)因子共同表達(dá)的結(jié)果，同時(shí)又受到多種內(nèi)外因素的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)、能量代謝障礙、炎性反應(yīng)、興奮性氨基酸釋放增加、氧自由基的生成等〔34〕。

長(zhǎng)期的研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3、NF-κB、Bcl-2 /Bax等多種凋亡調(diào)控因子均參與了腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這些因子分別作用于不同的環(huán)節(jié),對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡起調(diào)控作用。此外，在腦缺血再灌注損傷中這些凋亡調(diào)控因子并不是單獨(dú)表達(dá)的，它們之間通過(guò)相互作用，共同構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生。如Caspase-3作為Bcl-2的生理性半胱氨酸蛋白酶，對(duì)Bcl-2蛋白具有重要的酶解修飾作用，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，通過(guò)酶切Bcl-2蛋白來(lái)抑制Bcl-2的抗凋亡作用；另一方面，Bcl-2作為Caspase-3的上游調(diào)控因子，其過(guò)度表達(dá)可以有效抑制各種因素誘導(dǎo)的Caspase-3激活和由此產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡〔35〕。Bax可以誘導(dǎo)Cyt-c的釋放，通過(guò)細(xì)胞凋亡的線粒體通路激活Caspase-3蛋白酶，引起細(xì)胞凋亡；同時(shí)又可以誘導(dǎo)Bcl-2等抗凋亡相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)〔36〕，加速細(xì)胞凋亡。NF-κB激活后可以通過(guò)相關(guān)途徑上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，阻止Caspase-3等的活化而抑制細(xì)胞凋亡?？傊@些凋亡調(diào)控因子通過(guò)相互作用來(lái)共同完成對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控，而不僅僅是在各自凋亡通路上單獨(dú)發(fā)揮作用。因此，對(duì)這些細(xì)胞凋亡調(diào)控因子的深入研究，尤其是將其作為一個(gè)整體來(lái)綜合研究，將有利于我們進(jìn)一步探索腦缺血再灌注損傷的機(jī)制，為臨床上腦血管病的預(yù)防及治療提供新的科學(xué)依據(jù)。

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