邢進(jìn)，馮育芳，岳秉飛，賀爭(zhēng)鳴

(中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050)

1 概述

嗜肺巴斯德桿菌(Pasteurella pneumotropica，PP)屬于巴斯德菌科(Pasteurellaceae)，巴斯德菌屬(Pasteurella)，是一種革蘭陰性，無(wú)動(dòng)力，無(wú)芽孢的短桿或球桿菌。PP 主要有兩種生物型，分別是Jawetz生物型和Heyl 生物型，二者對(duì)碳源和氨基酸的利用有所不同。

PP 作為一種條件致病菌，分布廣泛，主要感染嚙齒類動(dòng)物，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中小鼠、大鼠和豚鼠的危害較大。在國(guó)內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，PP 是目前感染率最高的病原菌之一［1，2］。PP 也是人獸共患病原，能夠引起免疫缺陷動(dòng)物或免疫功能低下的動(dòng)物發(fā)病，引起人的局部和全身感染。與Haemophilus-Pasteurella-Actinobacillus(HPA)中的菌株(如流感嗜血桿菌、多殺巴斯德桿菌等)相比，對(duì)其研究還很欠缺。本文通過(guò)對(duì)PP 的檢測(cè)方法、分型研究、毒力因子、免疫應(yīng)答和防控措施等方面進(jìn)行綜述，了解PP 在國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀，促進(jìn)對(duì)PP 檢測(cè)的準(zhǔn)確性和研究的深入。

2 感染和致病性

2.1 動(dòng)物感染

PP 能夠感染嚙齒類動(dòng)物和其他動(dòng)物，如貓、狗和禽類等。某些寄生蟲(chóng)可以作為中間宿主。有報(bào)道顯示，脾體內(nèi)攜帶的人獸共患病原中，PP 所占比例最高，分布最廣泛［3］，極易通過(guò)叮咬進(jìn)行傳播。

PP 主要能夠引起動(dòng)物肺、子宮、眼部以及腸道的感染，可以在小腸內(nèi)生長(zhǎng)繁殖。一般臨床癥狀為皮下膿腫及眼炎、結(jié)膜炎、淚腺炎、子宮炎癥等。從發(fā)病嚙齒動(dòng)物的上呼吸道(鼻咽部)，結(jié)膜和鼻淚管及其他組織中，包括氣管、肺、膀胱、表皮、精囊、陰道和子宮均可分離到此菌。PP 引起動(dòng)物發(fā)病取決于感染菌株、動(dòng)物的品種、品系及環(huán)境因素等。包括免疫功能是否異常，是否混合感染其他病原菌，飼養(yǎng)密度的大小，以及所進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等。ATCC35149和CNP160 兩NAD 依賴型標(biāo)準(zhǔn)株感染F344 大鼠后，可至大鼠噴嚏。病理檢查可見(jiàn)鼻腔黏膜的炎癥和壞死。而NAD 非依賴型的菌株無(wú)致病性和病理變化［4］。乳鼠更易發(fā)生鼻咽部的感染，經(jīng)接觸上呼吸道、子宮的分泌物或糞便形成感染。

不同動(dòng)物來(lái)源的PP 菌株對(duì)宿主有著較強(qiáng)的選擇適應(yīng)性，大鼠分離株不一定能夠感染小鼠，而小鼠分離株則可以感染大鼠。Boot 將大、小鼠來(lái)源的PP人工感染小鼠，先感染了PP 小鼠株(生物型Jawetz，NCTC 8141)后，再被感染大鼠株(生物型Heyl，SSI P331)。證實(shí)兩株P(guān)P 不能同時(shí)存在于小鼠體內(nèi)，之前所感染的小鼠株被后感染的大鼠株競(jìng)爭(zhēng)性去除［5］。

2.2 人類感染

人感染此菌多數(shù)情況是接觸了帶菌寵物，被咬傷、抓傷后受到感染。不同年齡和型別的人均可感染，主要引起關(guān)節(jié)炎、膿腫，嚴(yán)重者可發(fā)熱、盜汗、明顯消瘦和菌血癥。PP 可造成手術(shù)部位紅腫，流綠膿，造成院內(nèi)感染［6］。

2.3 毒力因子和免疫應(yīng)答

PP 的毒力因子尚不明確，但編碼RTX 毒素的pnxIA 和pnxIIA 兩基因在PP 感染后的表達(dá)量均有所升高。在早期階段，pnxIA 的表達(dá)量升高，而pnxIIA 在后期和平臺(tái)期升高。用Southern blotting 方法在82%的分離株中檢測(cè)到了pnxIA 基因，而pnxIIA為39%。兩基因的表達(dá)蛋白對(duì)綿陽(yáng)和嚙齒動(dòng)物的紅血球具有一定的溶血作用，推測(cè)這兩種基因很可能是PP 的毒力因子之一。另外pnxIIIA 的編碼蛋白對(duì)細(xì)胞的毒性與前兩種毒素蛋白相比，對(duì)細(xì)胞的毒性更小，可以粘附于細(xì)胞表面并存在于胞外基質(zhì)中，能增強(qiáng)對(duì)紅細(xì)胞的溶血作用［7］。

將PP 人工感染C57BL/6 小鼠后，IL1α，TNFalpha，CCL3，CXCL1，and CXCL2 等細(xì)胞因子在感染后7 d 均輕微上調(diào)。IL1β mRNA 在感染后28 d 仍呈上調(diào)狀態(tài)，而且不隨著感染菌量的多少而出現(xiàn)大的變化［8］。因此在進(jìn)行對(duì)數(shù)據(jù)要求精細(xì)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，避免動(dòng)物受到PP 污染非常必要。See 和Thomas［9］用流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)與PP的同源蛋白P4、P6、P26 和D15 免疫小鼠，證實(shí)P6等重組蛋白具有對(duì)小鼠的保護(hù)作用，能夠保護(hù)肺部不受PP 侵染。

3 檢測(cè)方法

3.1 分離培養(yǎng)和生化鑒定

PP 在血瓊脂平皿上37℃培養(yǎng)24～48 h，能夠形成0.5～1.5mm 左右灰白色，或者淺黃色，光滑圓潤(rùn)的不溶血菌落，少數(shù)菌株輕微溶血。但血瓊脂中加入血的不同會(huì)對(duì)溶血結(jié)果產(chǎn)生影響。有的菌株在馬血瓊脂培養(yǎng)基上溶血，而在羊血瓊脂培養(yǎng)基上則不溶血，相反的情況也會(huì)出現(xiàn)。Jawetz 型菌落的顏色通常為灰白色，Heyl 型菌落的顏色則為黃色。大多數(shù)菌株在麥康凱瓊脂上培養(yǎng)48h 不生長(zhǎng)。其表型和基因特征與放線菌屬相似，不同的菌株在吲哚和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的產(chǎn)生有所不同，不發(fā)酵甘露醇。另外菌株對(duì)NAD 的依賴性也可以作為PP 的鑒定指標(biāo)。

3.2 血清學(xué)方法

血清凝集試驗(yàn)是檢測(cè)PP 的一項(xiàng)重要參考項(xiàng)目。凝集試驗(yàn)所用陽(yáng)性血清是由全菌抗原免疫相應(yīng)動(dòng)物獲得的?；趦煞N生物型的差異，可疑菌株需要用生物型Jawetz 和Heyl 兩種免疫血清分別進(jìn)行檢測(cè)。由于全菌抗原極易發(fā)生交叉反應(yīng)，國(guó)內(nèi)已有研究用脂多糖(LPS)和外膜蛋白(OMP)作為免疫抗原，具有更好的抗原特異性和敏感性［10］。在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)遇到分離培養(yǎng)和血清凝集試驗(yàn)不能完成對(duì)PP 的有效檢測(cè)，這時(shí)還需要采用PCR 方法進(jìn)行驗(yàn)證。

3.3 PCR

3.3.1 基于16S rRNA

對(duì)PP 進(jìn)行PCR 鑒別的目的基因主要是16S rRNA、蛋白編碼基因、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)等。其中16S rRNA 進(jìn)化速率緩慢，區(qū)別力好，相對(duì)保守，在PP 的PCR 鑒定中也是最常用的區(qū)段。有的方法已被證明能夠?qū)⒋蟛糠諴P 菌株與巴斯德菌屬的其他菌株相區(qū)別。Wang 等［11］首先根據(jù)PP 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35149 株的16S rDNA 序列建立了PP 的PCR檢測(cè)方法。該方法對(duì)于檢測(cè)Jawetz 型具有很好的特異性，可得到395bp 的目的片段，但是不能對(duì)Heyl型進(jìn)行有效的擴(kuò)增。Nozu 等［12］同樣根據(jù)16SrRNA建立了能擴(kuò)增兩種生物型菌株的PCR 方法，目的片段均為296bp?？墒谴朔椒ㄌ禺愋圆患眩瑢?duì)巴斯德菌科的其他屬也會(huì)產(chǎn)生相同的目的條帶。在此之后，Bootz 等隨后建立巴斯德菌科的PCR 檢測(cè)方法，能夠?qū)Π退沟戮频陌退沟聴U菌屬、放線桿菌屬、嗜血桿菌屬等進(jìn)行檢測(cè)。該方法可以對(duì)巴斯德菌科的幾乎所有菌株進(jìn)行有效擴(kuò)增，擴(kuò)增出510bp 的目的條帶。但是其最大的不足是無(wú)法對(duì)上述種屬的菌株進(jìn)行區(qū)分，只能夠用于初篩是否含有巴斯德菌科的菌株，不能單獨(dú)用于PP 的檢測(cè)。Kodjo 等［13］將PCR和EcoRI 限制性酶切相結(jié)合擴(kuò)增16S rDNA，能將Jawetz 和Heyl 型的菌株分別切為596 /341bp 和346/218bp 兩組片段，成功的區(qū)分了兩型菌株。

Dole 等［14］根據(jù)兩型菌株分別設(shè)計(jì)了各自的16Sr RNA 檢測(cè)探針，達(dá)到了區(qū)分兩型的目的，與PCR 相比具有更好的特異性和敏感性。目前對(duì)于國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)而言，real-time PCR 的成本是其普遍應(yīng)用的最大障礙。

3.3.2 基于蛋白編碼基因

除了16S rRNA 基因外，編碼DNA 促旋酶B 亞單位蛋白基因(gyrB)更適合親緣關(guān)系相近菌株的區(qū)分。Hayashimoto 等［15］針對(duì)gyrB 基因設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物，能夠同時(shí)擴(kuò)增Jawetz 和Heyl 兩種生物型的PP。Jawetz 的擴(kuò)增產(chǎn)物為1039bp，Heyl 的產(chǎn)物為1033bp，一定程度上實(shí)現(xiàn)了一對(duì)引物同時(shí)區(qū)分兩種PP 生物型。不過(guò)兩種生物型產(chǎn)生的條帶太過(guò)接近，以至于無(wú)法從瓊脂糖電泳中用肉眼分辨。Dole等［15］利用編碼RNA 聚合酶β 亞基基因(rpoB)對(duì)PP 進(jìn)行檢測(cè)，產(chǎn)生560bp 的目的片段，盡管經(jīng)測(cè)序后能夠鑒別PP，問(wèn)題依然是不能將某些相近菌株區(qū)分開(kāi)。Gautier 等［16］根據(jù)多殺巴斯德桿菌Pm70 株設(shè)計(jì)的SodAint基因特異性引物，擴(kuò)增巴斯德菌科的菌株，通過(guò)對(duì)目的片段的測(cè)序?qū)崿F(xiàn)對(duì)巴斯德菌科菌株的鑒定區(qū)分。其中PP 分離株的SodAint基因與其他同科菌屬的差異最小，相似度大于98%，而典型菌株的相似度僅有92%，因此對(duì)sodAint基因的測(cè)序有可能成為PP 準(zhǔn)確快速鑒定的有效方法之一。

3.3.3 基于轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS

Benga 等［17］嘗試?yán)棉D(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)對(duì)從嚙齒動(dòng)物分離到的PP(Jawetz 和Heyl 型)、小鼠放線桿菌、鼠流感嗜血桿菌等56 株巴斯德菌科進(jìn)行鑒別。經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)種間的ITS 區(qū)間明顯不同，而同種的ITS 區(qū)間高度保守，能夠進(jìn)一步用于設(shè)計(jì)探針對(duì)巴斯德菌科各菌株的鑒別。

PP 在嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的感染率始終居高不下，對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的干擾始終存有隱患。另外它在臨床感染的趨勢(shì)也在逐漸增高，應(yīng)該引起我們足夠的重視，因此對(duì)PP 的檢測(cè)就顯得尤為重要。現(xiàn)階段單獨(dú)使用生化鑒定或是PCR 方法都有一定的局限性，傳統(tǒng)的生化鑒定結(jié)合血清學(xué)方法雖然經(jīng)典，但很可能由于檢測(cè)試劑和主觀判斷的差異而影響結(jié)果。市場(chǎng)上幾種自動(dòng)化細(xì)菌鑒定試劑盒對(duì)PP 的生化反應(yīng)仍然缺乏全面數(shù)據(jù)支持，經(jīng)常無(wú)法鑒定或鑒定錯(cuò)誤。通過(guò)16S rDNA 的測(cè)序表明，生化結(jié)果的準(zhǔn)確率僅有54.6%。使用Wang 的引物能擴(kuò)增出目的片段的菌株，PP 準(zhǔn)確率為100%。而且在假陽(yáng)性結(jié)果中，使用Nozu 的PCR 方法均能擴(kuò)增出目的片段。受限于Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中PP 序列信息的不足，PCR檢測(cè)方法的特異性、相近菌株區(qū)分和兩種生物型的區(qū)分仍然是亟待解決的問(wèn)題。

4 分型研究

4.1 表型分型

對(duì)PP 的表型分型主要包括菌株的菌落顏色、形態(tài)、溶血性、菌體顏色和生化反應(yīng)等。我們?cè)鴮?duì)164株P(guān)P 分離株的上述表型特征進(jìn)行了分析。受試的164 株菌株共分出了81 個(gè)型別，相似度59.5%～100%。結(jié)果沒(méi)有明顯體現(xiàn)出菌株與宿主、分離時(shí)間的相關(guān)性。

4.2 ARDRA(Amplified 16S ribosomal DNA restriction analysis)

Sasaki 等［18］對(duì)PP 的16S rDNA 用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ進(jìn)行酶切進(jìn)行分型，結(jié)果顯示這種方法能夠?qū)⑹茉嚨?2 株P(guān)P 酶切出4 種不同帶型。分型結(jié)果同樣沒(méi)有反應(yīng)出菌株與宿主間具有相關(guān)性。

4.3 基因測(cè)序

4.3.1 16S rDNA

對(duì)菌株16S rDNA 的序列比對(duì)分型相對(duì)更為簡(jiǎn)便直接，Sasaki 等［19］通過(guò)對(duì)30 株P(guān)P 16S rDNA 1344bp 片段(包括24 株分離株、3 株標(biāo)準(zhǔn)株和3 段Genbank 序列)比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，將參比序列分出5 種類型，分型結(jié)果能夠與菌株宿主和溶血性相對(duì)應(yīng)，顯示出一定的相關(guān)性。但是由于HPA 菌屬之間16S rDNA 的相似程度太高，僅依靠16S rDNA 很難實(shí)現(xiàn)對(duì)這些菌株的區(qū)分，仍需要生化試驗(yàn)和溶血性試驗(yàn)的輔助。

4.3.2 gyrB 基因

Hayashimoto 等［20］對(duì)49 株P(guān)P 分離株進(jìn)行了gyrB 基因的測(cè)序，繪制了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。受試菌株被分為了A、B 和C 三個(gè)基因簇，A 簇為Jawetz 型的小鼠分離株，B 簇為Heyl 型的大鼠分離株，C 簇為都為分離自小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和兔的Heyl 型菌株。說(shuō)明用gyrB 基因進(jìn)行分型，能夠很好的將兩種生物型的菌株分開(kāi)，能夠體現(xiàn)出分型與菌株宿主來(lái)源的關(guān)系。

4.4 PFGE

嗜肺巴斯德桿菌PFGE 分型所用限制性內(nèi)切酶主要是參考多殺巴斯德桿菌和流感嗜血桿菌。Sasaki 等［19］選擇ApaI 和NotI 限制性內(nèi)切酶對(duì)PP進(jìn)行PFGE 分型，兩種內(nèi)切酶的分型能力相似，分型的相似度分別為59%和75%。有14 株菌兩種內(nèi)切酶都不能夠有效分型，限制性內(nèi)切酶的選擇還有待更多的嘗試。

5 防治

5.1 自身免疫

PP 在免疫功能正常的動(dòng)物中一般呈隱性感染，不表現(xiàn)出任何的臨床癥狀。小鼠在感染后PP 后的第2 天，肺中的T 淋巴細(xì)胞(CD4 +和CD8 +)、自然殺傷細(xì)胞CD49b(DX5)和巨噬細(xì)胞F4/80 +明顯增多。而在感染后一周，這些細(xì)胞的又會(huì)恢復(fù)到正常范圍［21］。MHCII，Tlr4 和Nramp1 三個(gè)基因在小鼠肺部免疫中起著重要的作用，參與免疫的重要性程度為MHCII=Tlr4 ＞Nramp1。缺乏這三種基因的小鼠對(duì)PP 更加易感［22］。其中Tlr4 對(duì)防止PP 感染具有至關(guān)重要的作用。跨膜受體Tlr4 有助于巨噬細(xì)胞在感染早期對(duì)PP 進(jìn)行識(shí)別和清除，即使是缺乏CD4 +T 細(xì)胞，也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的保護(hù)。

5.2 藥物治療

PP 對(duì)1－4 代頭孢菌素類抗生素及四環(huán)素、哌拉西林、復(fù)方新諾明、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、青霉素等各類抗生素均敏感。通過(guò)藥敏試驗(yàn)表明大部分PP 菌株對(duì)恩氟沙星菌敏感，MIC ≤0.5 μg/mL［23］。用恩氟沙星經(jīng)由飲水長(zhǎng)期飼喂小鼠，可以有效去除小鼠種群中PP。而使用恩氟沙星是否會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、微生物菌群和生理指標(biāo)造成影響有待進(jìn)一步研究。

5.3 環(huán)境因素

在各種環(huán)境因素中，飲水、飼料、墊料和換氣次數(shù)等是主要應(yīng)該控制的項(xiàng)目。室溫下(20～25℃)，PP 在PBS 中最長(zhǎng)可存活6 d，在蒸餾水和自來(lái)水中只能存活3d［24］。在飼料、墊料中，PP 的污染幾率也很小，即便是純培養(yǎng)的PP 菌落，血瓊脂培養(yǎng)基上存活也不會(huì)超過(guò)一周。飲水、飼料和墊料的污染并不是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染PP 的主要原因。

使用強(qiáng)制空氣通風(fēng)微隔離系統(tǒng)(FVMIS)，可以有效避免PP 在小鼠之間的傳播。而同樣條件下飼養(yǎng)在開(kāi)放環(huán)境中的小鼠則感染了PP。由此可見(jiàn)，空氣的凈化對(duì)控制PP 的傳播是至關(guān)重要的。相信隨著獨(dú)立通風(fēng)籠具(IVC)的廣泛使用，以及嚴(yán)格的飼養(yǎng)管理，包括PP 在內(nèi)的呼吸道病原菌能夠得到有效的控制。

6 公共衛(wèi)生意義

到目前為止，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)嗜肺巴斯德桿菌感染人的報(bào)道。但根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物監(jiān)測(cè)的結(jié)果可以推測(cè)，該菌在我國(guó)環(huán)境中同樣廣泛存在。由于流浪貓、犬的大量存在，以及飼養(yǎng)各種動(dòng)物作為寵物的人越來(lái)越多，該菌的暴露人群的基數(shù)是非常龐大的。這些動(dòng)物都可能作為該菌的中間宿主，通過(guò)抓咬感染予人，因此應(yīng)該引起我們足夠的重視。

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