張彩勤，張海，趙勇，毛峰峰，白冰，師長宏

(第四軍醫(yī)大學實驗動物中心， 西安 710032)

近紅外熒光染料(near infrared dye, NIR)是一類聚甲基菁染料的雜環(huán)化合物，自發(fā)熒光低[1]，但與體內(nèi)大分子結(jié)合后由于熒光團的聚集展示出強的熒光素；利用近紅外熒光進行活體成像具有非侵襲性、分辨率高、無輻射、可動態(tài)成像等優(yōu)點[2]，目前成為分子影像的研究熱點，并廣泛應(yīng)用于腫瘤研究領(lǐng)域。事實上利用熒光染料進行腫瘤的檢測和診斷還面臨一系列的問題[3,4]，如常用的腫瘤成像是將近紅外熒光染料通過與腫瘤特異的配體發(fā)生化學偶聯(lián)來實現(xiàn)的，腫瘤特異的配體包括代謝底物、適體、生長因子和抗體等，已有文獻報道NIR熒光染料與細胞膜受體、胞外基質(zhì)、癌細胞特異的標志分子和新生血管內(nèi)皮細胞特異的標志分子等作用的機制[5]。上述NIR染料腫瘤成像的缺陷是只能檢測到部分具有特異表面標志的癌細胞類型，而且這種化學偶聯(lián)機制可能改變靶標配體的特異性和親和力[6]。因此，迫切需要開發(fā)一種NIR熒光染料，使腫瘤成像變得更簡單、更有效。

IR-783是一種七次甲基熒光染料，它既可以被激發(fā)出近紅外熒光，又可以作為靶標配體，能夠被癌細胞攝取并富集，而不需要通過化學偶聯(lián)的途徑[7]，具有成像和靶分子的雙重功能。本實驗主要通過觀察近紅外熒光染料IR-783在自發(fā)性腫瘤犬中的成像效果，探索IR-783用于臨床腫瘤診斷的前景。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 熒光染料

近紅外熒光染料IR-783(excitation, 760～800 nm；emission, 820～860 nm)，由美國洛杉磯Cedars-Sinai Medical Center饋贈[7]。

1.1.2 儀器設(shè)備

Caliper Lumina II 小動物光學成像系統(tǒng)；Olympus IX71熒光顯微鏡。

1.1.3 實驗動物

裸鼠，雌性，8～10 周，6只，來源于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心【SCXK(軍)2012-0007】，飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心【SYXK(軍)2012-0023】；犬由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心寵物醫(yī)院提供，實驗過程均經(jīng)過第四軍醫(yī)大學實驗動物倫理委員會的批準，并按照實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

前列腺癌細胞PC-3和胃癌細胞SGC-7901由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，將這兩株細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，1000 r/min離心，用無血清RPMI-1604培養(yǎng)液制成細胞懸液，在裸鼠后肢背側(cè)皮下注射，每點0.2 mL，注射量為2×106個細胞，3只裸鼠注射PC-3細胞，另外3只裸鼠注射SGC-7901細胞。

1.2.2 IR-783在裸鼠腫瘤模型中的代謝試驗[8,9]

當裸鼠的皮下細胞瘤長至直徑約0.5 cm時，將IR-783染料按照5 μmol/kg的劑量腹腔注射PC-3腫瘤和SGC-7901腫瘤裸鼠各2只，另外兩只荷瘤裸鼠作為無注射對照。注射后每天在Caliper Lumina II 小動物光學成像系統(tǒng)中進行活體熒光成像(ex: 745 nm，em: ICG)，連續(xù)觀察9 d。

1.2.3 IR-783在犬自發(fā)腫瘤中的靶向研究

4只自發(fā)腫瘤犬，分別編為1、2、3、4號犬。1號犬是乳房腫瘤，2號犬是面部腫瘤，3號犬為多臟器轉(zhuǎn)移腫瘤，4號犬為肛門部位腫瘤。將IR-783按照1.5 μmol/kg后肢靜脈注射4只實驗犬，在注射后第5天手術(shù)切除腫瘤組織，并取部分正常組織作對照，將切除的組織在Caliper Lumina II 小動物光學成像系統(tǒng)中進行熒光顯影，成像后將各部分組織分別用4%多聚甲醛固定，制作HE染色切片進行組織病理學觀察，制作冰凍切片用于觀察組織的IR-783近紅外熒光。

2 結(jié)果

2.1 IR-783在裸鼠腫瘤模型中的代謝實驗

荷瘤裸鼠腹腔注射5 μmol/kg的熒光染料IR-783后，活體熒光成像連續(xù)觀察9d，如圖1(彩插2)所示，8 d后，體內(nèi)正常組織非特異性結(jié)合的熒光染料基本消失，而在腫瘤組織中仍有很強的特異性熒光顯影。

2.2 IR-783在犬自發(fā)腫瘤中的成像研究

2.2.1 1號犬的成像結(jié)果與組織病理分析

將1號犬切除的腫瘤組織在小動物活體成像儀中進行熒光成像，結(jié)果在腫瘤組織中有明顯的熒光信號，而在腫瘤附近正常的肌肉組織中無熒光出現(xiàn)(見圖2，彩插2)。病理HE結(jié)果顯示熒光強的組織內(nèi)部分乳腺細胞的核深染，細胞核大小不均一，具有明顯的腫瘤細胞特征(見圖2，彩插2)。

2.2.2 2號犬的成像結(jié)果與組織病理分析

將2號犬的腫瘤組織及附近眼觀正常的組織同時做熒光成像、HE染色切片和冰凍切片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤部位有較強的熒光，而眼觀正常的組織上只有較弱的熒光(見圖3，彩插3)。HE病理結(jié)果診斷該腫瘤組織為淋巴瘤(見圖3，彩插3)，附近的組織同時有腫瘤細胞侵襲。冰凍切片的熒光觀察結(jié)果是腫瘤組織的熒光較強，腫瘤附近切除的組織有較弱的熒光(見圖3，彩插3)，與HE切片的組織病理結(jié)果一致。

2.2.3 3號犬的成像結(jié)果與組織病理分析

3號犬在注射IR-783后第7天死亡，進行解剖后發(fā)現(xiàn)肝臟和胃已經(jīng)黏連在一起，肺臟、脾臟等都可見明顯的病理變化。切除肝臟、胃、脾臟、肺臟、十二指腸、胸腺的8塊組織樣品，組織熒光成像、HE染色切片和冰凍切片結(jié)果均表明采集的8塊組織均有程度不一的腫瘤細胞侵襲或壞死病變(見圖4，彩插3)。

2.2.4 4號犬的成像結(jié)果與組織病理分析

4號犬在肛門部位有一個較大的腫瘤(見圖5A，彩插3)，手術(shù)切除了整個的腫瘤組織，選取較小的一塊腫瘤組織和兩塊帶有正常組織的腫瘤進行了熒光成像和HE切片觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織處可見較強熒光信號，正常的組織未見熒光顯影(見圖5B，彩插3)。組織病理HE分析結(jié)果與熒光檢測一致。

3 討論

Ntziachristos 等[10]已證實近紅外熒光最大可穿透12 cm的乳腺或肺組織、6 cm的肌肉組織和5 cm的成人腦組織，在癌癥研究和腫瘤檢測中顯示出較多的優(yōu)勢[11]，各種各樣的花菁衍生物被開發(fā)用于檢測癌細胞[12-14]。本研究使用的IR-783熒光染料發(fā)射波長(820～860 nm)較一般可見的熒光染料更長，經(jīng)過前期的修飾，已具有突出的優(yōu)勢：不需要化學偶聯(lián)即可以直接檢測癌細胞和癌癥轉(zhuǎn)移灶；能夠檢測出許多不同類型的腫瘤細胞群[7,15]。無論染料本身的穩(wěn)定性還是檢測結(jié)果的信噪比都相對更好，在細胞組織水平的研究中具有一定優(yōu)勢[16,17]。

本實驗通過熒光成像和組織病理分析證實了近紅外熒光染料IR-783可與犬的腫瘤組織特異性結(jié)合，并在腫瘤部位富集，具有一定的靶向性能力。同時，選用不同類型的腫瘤模型表明了IR-783與腫瘤細胞結(jié)合的廣泛性。已有的報道證實IR-783染料能夠聚集在癌細胞的線粒體和溶酶體部位，可能是通過有機陰離子轉(zhuǎn)移肽系統(tǒng)(OATPs)將IR-783運輸進入癌細胞并貯留在癌細胞中而非正常細胞中。而OATPs在人類的多種腫瘤組織和多種腫瘤細胞系中大量表達[18]，這可能也是IR-783能夠與腫瘤細胞特異性結(jié)合的分子機制。

已有NIR熒光染料成像研究均采用小鼠腫瘤模型，其實驗結(jié)果與人體研究存在較大差別。研究發(fā)現(xiàn)犬的基因組與人的基因組相似度遠遠高于嚙齒類動物與人[19]；犬的腫瘤模型在組織病理特點、遺傳特性、生物行為學以及對治療的反應(yīng)性方面具有人體腫瘤的基本特點[20]。同時，使用犬的腫瘤模型開展非臨床研究可以解決在其他腫瘤模型中無法解決的問題。因此，本實驗在完成裸鼠腫瘤模型研究的基礎(chǔ)上，選用犬的自發(fā)腫瘤模型開展了IR-783近紅外熒光染料的靶向作用研究，證明了該染料與腫瘤組織結(jié)合的特異性，為其應(yīng)用于臨床腫瘤成像研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

實驗過程中由于Caliper Lumina II 小動物光學成像系統(tǒng)的成像范圍有限(一次只能成像三只小鼠)，犬的表皮組織較厚，近紅外染料無法穿透，導致不能在犬活體進行腫瘤組織的熒光成像，只能是將組織切除后選取病變典型的組織在活體成像儀中顯影。通過活體成像對照組織病理分析結(jié)果確診組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，進一步驗證二者的一致性。本實驗中選取了4只自發(fā)腫瘤犬進行研究，數(shù)量有限。后續(xù)實驗將大量收集不同來源的自發(fā)腫瘤犬進行腫瘤成像的研究，累積研究結(jié)果，積極與臨床病理診斷結(jié)果相比較，更加深入地研究IR-783染料在腫瘤檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。

(本文圖1,2見彩插2,圖3～5見彩插3。)

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