殷安國(guó)，匡德宣，李曉飛，張媛，孫曉梅，夏雪山，代解杰

(1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹(shù)鼩種質(zhì)資源中心，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650118;)

樹(shù)鼩(Tupaia belangeri，tree shrew)，一種廣泛存在于南亞、東南亞和中國(guó)西南地區(qū)［1］的動(dòng)物，現(xiàn)在被歸為攀鼩目.最近幾十年來(lái)，因?yàn)樽鳛橐环N實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，擁有著多種獨(dú)特的特質(zhì)(例如，體積小，腦與身體的比重大，生殖周期短，飼養(yǎng)花費(fèi)少，最重要的是，被認(rèn)為與靈長(zhǎng)類關(guān)系非常近)，樹(shù)鼩已經(jīng)被提議在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物安全測(cè)試方面［2］可替換靈長(zhǎng)類動(dòng)物成為有效的動(dòng)物模型。

當(dāng)今，有許多研究人員嘗試用樹(shù)鼩來(lái)構(gòu)建動(dòng)物模型，這樣能更好的研究丙型肝病毒(HCV)［3］和乙型肝炎病毒(HBV)［4］感染、近視、競(jìng)爭(zhēng)壓力和抑郁癥。

1 肝炎病毒

1.1 甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus，HAV)

在甲型肝炎病毒方面，詹美云等［5］讓樹(shù)鼩口服甲肝病毒陽(yáng)性病人新鮮大便濾液，并在隨后的時(shí)間里，可在樹(shù)鼩糞便里檢測(cè)出甲肝抗原，此抗原可被甲肝恢復(fù)期病人血清中和，且感染2～16 周的樹(shù)鼩血清中可檢測(cè)出甲肝抗體，抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率78%，從電鏡中觀察到感染樹(shù)鼩糞便中的病毒顆粒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步的說(shuō)明了樹(shù)鼩可能成為甲肝病毒的敏感動(dòng)物，但是否引起樹(shù)鼩肝病變尚無(wú)明確研究。

1.2 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)

我國(guó)是HBV 感染高發(fā)區(qū)，在我國(guó)的感染者約1.2 億以上，在HBV 感染原代樹(shù)鼩肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，Walter 等［6］在HBV 感染的原代樹(shù)鼩肝細(xì)胞中檢測(cè)到病毒的DNA 和RNA 合成，在培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到分泌的HBsAg 和HBeAg。他們的發(fā)現(xiàn)證明樹(shù)鼩肝細(xì)胞本身適合靈長(zhǎng)類動(dòng)物HBV 復(fù)制。在HBV體內(nèi)感染樹(shù)鼩實(shí)驗(yàn)中，Walter［6］等在感染4 日齡幼樹(shù)鼩時(shí)，血清學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)幼齡樹(shù)鼩感染類似于人類急性自限性乙型肝炎，認(rèn)為在樹(shù)鼩體內(nèi)感染時(shí)病毒的復(fù)制和基因表達(dá)水平可能較低。楊芳等［7］用新生樹(shù)鼩感染人HBV，證實(shí)病毒能在樹(shù)鼩體內(nèi)長(zhǎng)期存在并穩(wěn)定復(fù)制。龐其方等［8］用HBV 陽(yáng)性人血清肌注感染樹(shù)鼩，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樹(shù)鼩可能是繼黑猩猩和長(zhǎng)臂猿之后對(duì)HBV 敏感的動(dòng)物。蘇建家等［9］用人HBV接種53 只樹(shù)鼩，發(fā)現(xiàn)45 只樹(shù)鼩(84.9%)的血清和肝細(xì)胞有人HBV 標(biāo)記物，利用血清學(xué)、免疫組化、分子雜交及電鏡檢查等技術(shù)，在接種了人HBV 的樹(shù)鼩血中可查見(jiàn)HBsAg 及Dane 顆粒，在肝細(xì)胞也檢測(cè)出HBsAg、HbcAg 和HBV DNA，表明樹(shù)鼩可作為人HBV 感染模型。Huan 等［10］繪制了一幅高質(zhì)量的樹(shù)鼩肝細(xì)胞基因表達(dá)圖譜，經(jīng)過(guò)深入分析后，發(fā)現(xiàn)肝臟膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(NTCP，?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽)會(huì)與乙肝病毒包膜蛋白的關(guān)鍵受體結(jié)合域發(fā)生特異性相互作用，隨后進(jìn)行了一些系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證明肝臟膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的確是HBV 病毒感染所需的細(xì)胞受體。

盡管有上述HBV 實(shí)驗(yàn)感染樹(shù)鼩感染率較低，但隨著樹(shù)鼩肝細(xì)胞HBV 受體的發(fā)現(xiàn)，及受體進(jìn)一步的深化研究，樹(shù)鼩用來(lái)做感染HBV 的動(dòng)物模型的可靠性和實(shí)用性也會(huì)得到提高。

1.3 丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)

在2005 年，趙西平等［11］證實(shí)了在樹(shù)鼩的原代肝細(xì)胞中HCV 病毒確實(shí)可以復(fù)制，研究人員用從HCV 陽(yáng)性病人身上獲得血清或血漿感染樹(shù)鼩原代肝細(xì)胞，用RT-PCR 方法檢測(cè)到了負(fù)鏈RNA，這確認(rèn)了樹(shù)鼩被感染和病毒的復(fù)制，HCV RNA 可以一直檢測(cè)到接種后第14 天。組裝好的病毒可以不被RNA酶降解，且具有感染其他健康樹(shù)鼩的能力。謝志春等［12］比較了正常樹(shù)鼩和經(jīng)750cGy 的X 射線全身輻照樹(shù)鼩的感染HCV 狀況，發(fā)現(xiàn)輻照后的樹(shù)鼩對(duì)HCV 表現(xiàn)出了更高的易感性且病毒持續(xù)時(shí)間明顯增長(zhǎng)。提示輻照等方式是降低動(dòng)物免疫能力，促進(jìn)感染慢性化的一種方法。2010 年，Amako 等［13］報(bào)道了被HCV 全長(zhǎng)cDNA 感染后長(zhǎng)達(dá)3 年的樹(shù)鼩跟蹤研究，在急性感染期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物顯示出了輕微的炎癥和病毒血癥，隨后發(fā)展為脂肪肝、肝硬化、肝腫瘤的發(fā)生。從這些已被感染的樹(shù)鼩中抽取的血清通過(guò)靜脈注射到健康樹(shù)鼩后，會(huì)導(dǎo)致健康樹(shù)鼩發(fā)生急性感染，這表明HCV 病毒可以在樹(shù)鼩體內(nèi)有效的復(fù)制且復(fù)制后的病毒具有感染其他樹(shù)鼩的能力。

綜上所述，樹(shù)鼩可急性感染HCV，同時(shí)原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)后可感染HCV，但是HCV 感染樹(shù)鼩后病毒的復(fù)制及表達(dá)水平不高，故慢性HCV 丙肝模型有待進(jìn)一步探索。另外，目前我國(guó)的樹(shù)鼩多為野生型，ALT 基礎(chǔ)水平偏高，許多學(xué)者對(duì)所得的感染結(jié)果提出質(zhì)疑。在樹(shù)鼩體內(nèi)外進(jìn)行丙肝機(jī)制的研究，為丙型肝炎的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防治療及新藥的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)?？梢钥吹?，隨著研究的深入，樹(shù)鼩有望成為HCV 感染的理想動(dòng)物模型。

1.4 丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus，HDV)

HDV 是一種缺陷病毒，需HBV 輔助才能進(jìn)行復(fù)制，所以HDV 感染者首先要有HBV 感染。丁明權(quán)等［14］用HDV/HBV 陽(yáng)性人血清經(jīng)同時(shí)和重疊感染方式接種于成年樹(shù)鼩后，定期留取感染樹(shù)鼩血清及肝組織，檢測(cè)血清中HBsAg、HDAg、抗-HD、HBV DNA 及HDV RNA，研究發(fā)現(xiàn)成年樹(shù)鼩對(duì)人HBV 易感，HBsAg 陽(yáng)性率為75%，部分樹(shù)鼩經(jīng)分子雜交證實(shí)其血清及肝內(nèi)有HBV DNA 存在。在感染HBV的基礎(chǔ)上，經(jīng)分子雜交檢測(cè)，其血清及肝內(nèi)亦有HDV RNA 存在，部分樹(shù)鼩血清HDAg、抗-HD 陽(yáng)性。肝組織病理檢查顯示，肝細(xì)胞有明顯的變性壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，較單純HBV 感染時(shí)重。李奇芬等［15］觀察到的結(jié)果也與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，血清學(xué)表現(xiàn)及肝組織病變與在黑猩猩實(shí)驗(yàn)感染HDV 中觀察到的情況十分相似，提示成年樹(shù)鼩可用于丁型肝炎動(dòng)物模型的研究。

2 腸道病毒EV71(Human enterovirus 71，EV71)

手足口病多發(fā)于5 歲以下兒童，可引起手、足、口腔等部位的皰疹，甚至可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和相關(guān)心肺功能衰竭等癥狀，常見(jiàn)的引起手足口病的病毒為腸道病毒EV71。王文廣等［16］對(duì)3 月齡的樹(shù)鼩采用灌胃、滴鼻、尾靜脈注射3 種方式進(jìn)行感染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組樹(shù)鼩在第4 天前后出現(xiàn)體溫升高，白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞水平也有類似變化;病毒載量在3 種攻毒方式的實(shí)驗(yàn)組樹(shù)鼩中均可被檢測(cè)到，峰值出現(xiàn)在第10 天前后，灌胃途徑尤為明顯，血清的最大中和抗體效價(jià)為1∶16。在第2 周左右，部分實(shí)驗(yàn)組樹(shù)鼩出現(xiàn)急性松弛性癱瘓，解剖后發(fā)現(xiàn)伴有尿潴留癥狀;通過(guò)組織病理學(xué)檢查可以發(fā)現(xiàn)發(fā)病樹(shù)鼩在腦、肺、腸、脾臟、腎等部位發(fā)生病理變化。該實(shí)驗(yàn)表明EV71 病毒通過(guò)灌胃、滴鼻和靜脈注射3 種方式均可感染中緬樹(shù)鼩，這為以后研究EV71 感染樹(shù)鼩的致病機(jī)理、建立手足口病動(dòng)物模型奠定了基礎(chǔ)，但EV71 是否對(duì)各年齡段的樹(shù)鼩均可感染還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 單純皰疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)

單純皰疹病毒(HSV)屬皰疹病毒科單純皰疹病毒屬。HSV 可分為HSV-1 和HSV-2，HSV-1 主要引起腰以上感染;HSV-2 主要?jiǎng)t與腰以下感染有關(guān)。Darai 等［17］采用靜脈注射、腹腔注射、皮下注射這3種方式給1 月齡(28～45d)和成年樹(shù)鼩(150d)注射HSV 1 或HSV 2 型病毒，在感染后第2 天幼年樹(shù)鼩即出現(xiàn)臨床癥狀，隨后死亡。從肝臟和脾臟中可獲得高滴度的HSV 病毒。病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝臟部分區(qū)域壞死等嚴(yán)重的肝臟變化，形態(tài)學(xué)上變化為出現(xiàn)皰疹肝炎，其他臟器亦出現(xiàn)病理變化，如腦炎和脾臟中的纖維化。這些結(jié)果顯示出HSV 1 和HSV 2在幼年樹(shù)鼩身上的高致病性。相反的，成年樹(shù)鼩沒(méi)有發(fā)現(xiàn)臨床癥狀和HSV 病毒。

4 流感病毒(Influenza virus)

流感是最常見(jiàn)的多發(fā)病之一，但是目前尚無(wú)較為合適的動(dòng)物模型。雪貂雖敏感，但不易獲得。小鼠必須連續(xù)傳代，才可適應(yīng)。而幼年或初生者的金黃倉(cāng)鼠、大鼠、豬等較敏感。至于猴、豚鼠、狗等接種后多為不顯性感染。朱宇同等［18］用3 種流感病毒對(duì)樹(shù)鼩由鼻腔滴入接種，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接種后的三天中，新A1型或A3型，樹(shù)鼩的平均肛溫與接種前相比有明顯的增加。C 型流感病毒感染的樹(shù)鼩則無(wú)體溫升高。B 型流感病毒感染后，體溫略有升高，但半數(shù)個(gè)體無(wú)發(fā)熱反應(yīng)。樹(shù)鼩在感染A 型或B 型后，可從鼻咽液分離出流感病毒，持續(xù)排毒長(zhǎng)者可達(dá)17 天，接種C 型流感病毒的樹(shù)鼩未能從鼻咽液中分離出病毒，但血清抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，可能為隱形感染排毒甚少。接種前樹(shù)鼩血液均未檢出流感抗體，接種后絕大多數(shù)樹(shù)鼩產(chǎn)生抗體，2～3 周為高峰，常規(guī)法滴度達(dá)1∶60～1∶1280 左右。2 只樹(shù)鼩置于隔壁僅有一小窗空氣相通，發(fā)現(xiàn)亦能發(fā)生接觸交叉感染。用云南樹(shù)鼩感染流感病毒A3 型、新A1 型或B 型均獲成功，出現(xiàn)規(guī)律排毒且有抗體增長(zhǎng)，多數(shù)有上呼吸道感染癥狀，體溫曲線不規(guī)律，可通過(guò)接觸感染，因此樹(shù)鼩可能是用于研究流感病毒的較好動(dòng)物模型，值得我們進(jìn)一步深入研究并不斷完善此模型。

5 輪狀病毒(Rotavirus)

輪狀病毒是秋季嬰兒胃腸炎的主要病原。萬(wàn)新邦等［19］用含有輪狀病毒的嬰兒腹瀉糞液，經(jīng)處理后分為不同濃度的上清液對(duì)實(shí)驗(yàn)樹(shù)鼩進(jìn)行灌胃感染，最早于第2 天排稀糞，全部發(fā)病，普遍表現(xiàn)為呆滯蜷縮，體毛蓬松，食欲減退，體重減輕。個(gè)別樹(shù)鼩腹瀉頻繁，嚴(yán)重脫水后死亡，病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)死亡樹(shù)鼩的十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸腸腔內(nèi)均有腸上皮細(xì)胞和腸絨毛脫落，有較多淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，回腸淋巴小節(jié)增生。通過(guò)電鏡檢查均在樹(shù)鼩的糞液中找到輪狀病毒，用發(fā)病樹(shù)鼩的糞液感染第2 代及第3 代樹(shù)鼩，亦可在發(fā)病期間檢測(cè)到全部和2/3 的陽(yáng)性結(jié)果。血清抗人輪狀病毒抗體在病程中有4 倍以上增長(zhǎng)。這些結(jié)果表明成年樹(shù)鼩可能是對(duì)人輪狀病毒的易感動(dòng)物。

6 基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)

基孔肯雅熱是由基孔肯雅病毒引起的一種人獸共患病，主要流行于非洲和東南亞地區(qū)。張海林等［20］用從蝙蝠和基孔肯亞熱陽(yáng)性患者體內(nèi)分離到的病毒以及國(guó)外原型株ROSS 這3 株基孔肯雅病毒感染樹(shù)鼩后，動(dòng)物出現(xiàn)飲食減少，活動(dòng)差，3 株病毒感染的樹(shù)鼩均能產(chǎn)生病毒血癥，12 只樹(shù)鼩中有11只產(chǎn)生血凝抑制(HI)抗體、中和(NT)抗體、補(bǔ)體結(jié)合(CF)抗體，血凝抑制抗與中和抗體二者相關(guān)性非常顯著(P＜0.01)。且能在其腦、肺、肝、脾和腎等組織中檢測(cè)到病毒，病理檢測(cè)顯示這些內(nèi)臟組織呈炎性改變和出血傾向，表明基孔肯亞病毒能侵襲樹(shù)鼩各主要臟器，認(rèn)為樹(shù)鼩對(duì)基孔肯亞病毒敏感。樹(shù)鼩感染基孔肯亞病毒后的病毒血癥滴度足以感染蚊蟲(chóng)，在該病毒的保存和傳播中可能具有一定流行病學(xué)意義，有必要進(jìn)行深入研究。

7 腺病毒(Adenovirus，ADV)

陳元鼎等［21］運(yùn)用聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)從90份云南樹(shù)鼩大便中檢出12 份含腺病毒的糞便樣品，用電鏡(EM)觀察到樣品中含有典型腺病毒顆粒，陽(yáng)性率為13%，這進(jìn)一步證實(shí)了PAGE 的結(jié)果。病毒DNA 電泳圖型類似于腸道腺病毒，但血凝實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些病毒具有低滴度的凝聚人O 型、B 型紅細(xì)胞的作用，這種樹(shù)鼩腺病毒的血清學(xué)關(guān)系與人類腺病毒之間的關(guān)系以及能否將人類腺病毒運(yùn)用到樹(shù)鼩身上建立一種成熟的動(dòng)物模型尚待進(jìn)一步研究。

8 問(wèn)題與展望

大小鼠在HBV 和HCV 方面亦有很深的研究，如蔣黎等［22］運(yùn)用宮內(nèi)注射人胎肝細(xì)胞形成免疫耐受的方法建立人鼠嵌合肝HBV 感染模型及Michael等［23］采用給缺陷小鼠注射肝祖/干細(xì)胞的方法建立人源化小鼠HCV 感染模型，但人鼠嵌合肝和人源化小鼠操作繁瑣，周期較長(zhǎng)，死亡率高，造價(jià)昂貴，故不利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。而近年來(lái)，樹(shù)鼩因它在生理、生化及解剖學(xué)等生物學(xué)特性方面與人類有著相似之處，正日益受到國(guó)內(nèi)外的關(guān)注，成為一種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但事實(shí)上我們?nèi)匀鄙籴槍?duì)樹(shù)鼩的特異性的專有檢測(cè)試劑及成品試劑盒，用人類或其他物種的檢測(cè)試劑盒來(lái)檢測(cè)樹(shù)鼩并不能真實(shí)且準(zhǔn)確的反映出實(shí)際的結(jié)果，所以要求獲得樹(shù)鼩大量的且系統(tǒng)的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、神經(jīng)系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等相關(guān)方面信息。一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用要求動(dòng)物的遺傳背景清晰，而實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)模化要求建立動(dòng)物封閉群和品系，這也是現(xiàn)階段亟需解決的問(wèn)題。隨著樹(shù)鼩全基因組序列的獲得及世界專家的重視，相信上述問(wèn)題最終會(huì)一一被解決，樹(shù)鼩將作為新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被研究人員廣泛的認(rèn)同和接受及使用。樹(shù)鼩在人類疾病動(dòng)物模型方面的優(yōu)勢(shì)對(duì)于探究人類疾病機(jī)理、消除人類疾病痛苦、提高人類生活水平方面將發(fā)揮著重大的作用。

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