徐 磊 趙 松 黨麗峰 齊 宇 楊 洋 劉東雷 吳 愷 王嘯林 鮑培龍

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450052)

表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是受體酪氨酸激酶(TK)HER/ErbB家族的一個(gè)重要成員，在包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中均為高表達(dá)，并能通過活化下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)化、血管生成及轉(zhuǎn)移〔1〕。研究顯示〔2〕，在抗腫瘤治療過程中EGFR-TKI厄洛替尼可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬表達(dá)水平上調(diào)。自噬是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、成熟分化及死亡的重要調(diào)控機(jī)制，與包括腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病有關(guān)〔3～7〕。自噬可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存、轉(zhuǎn)移并增加其耐藥性〔8〕,目前自噬在腫瘤細(xì)胞死亡或生存當(dāng)中的作用仍不清楚。本研究探討自噬在厄洛替尼(Erlotinib)誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞A549凋亡中的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人肺腺癌細(xì)胞株A549由河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室凍存，復(fù)蘇后在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d更換1次培養(yǎng)液，用胰酶細(xì)胞消化液(含0.25%胰酶和0.02%EDTA)消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。3-甲基腺嘌呤(3-MA)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。厄洛替尼(Erlotinib,商品名:特羅凱)由羅氏公司惠贈(zèng)，Acridine Orange購(gòu)于Biotopped公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640、不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶消化液購(gòu)自Solarbio公司，AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。Beclin1及半胱氨酸蛋白酶(Caspase9)多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞以1×105個(gè)/ml濃度接種于96孔板，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，分別加入一系列濃度梯度的3-MA及厄洛替尼，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液，藥物作用48 h以后每孔加入濃度為5 g/L的MTT 10 μl，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=〔1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組〕×100%。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/ml，接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入相應(yīng)濃度藥物作用48 h，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，離心收集懸浮細(xì)胞，用不含EDTA胰蛋白酶消化液消化收集貼壁細(xì)胞，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入400 μl AnnexinV結(jié)合液懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞濃度約為1×106個(gè)/ml，在細(xì)胞懸液中加入5 μl AnnexinV-FITC染色液，混勻，4℃避光孵育15 min，再加10 μl PI，混勻，4℃避光孵育5 min，立即上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4吖啶橙(AO)染色檢測(cè)細(xì)胞自噬變化 用胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以1×105個(gè)/ml濃度接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用實(shí)驗(yàn)濃度的Erlotinib和(或)3-MA處理細(xì)胞48 h，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，棄培養(yǎng)液，加終濃度為10 μg/ml的AO室溫避光孵育20 min，棄染液，PBS洗滌3次，用倒置熒光顯微鏡觀察酸性自噬泡的變化情況并攝片。

1.5Western印跡檢測(cè)細(xì)胞Beclin1和Caspase9蛋白的表達(dá) 用一定濃度的藥物處理細(xì)胞48 h同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)，通過測(cè)定吸光度值進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。制備12.5%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，每孔上樣量為100 μg，常規(guī)電泳，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入Beclin1及Caspase9抗體(工作濃度均為1∶500)4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌3次，10 min/次，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST再次洗滌3次，10 min/次，之后進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)，將結(jié)果掃描后用imagej軟件進(jìn)行灰度分析并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。β-actin為內(nèi)參照。

2 結(jié) 果

2.1MTT檢測(cè)結(jié)果 對(duì)于A549細(xì)胞而言，隨著厄洛替尼和3-MA濃度增加細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增加，厄洛替尼作用48 h時(shí)，細(xì)胞IC50值約為19.7 μmol/L，因此選用20 μmol/L作為實(shí)驗(yàn)劑量；3-MA作用48 h時(shí)，該細(xì)胞IC10值約為5 mmol/L,因此選用5 mmol/L作為實(shí)驗(yàn)劑量。

2.2AnnexinV/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 流式細(xì)胞儀檢測(cè)示，3-MA組細(xì)胞凋亡率為(9.47±0.15)%，與對(duì)照組〔(3.51±0.20)%〕相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。單用厄洛替尼組細(xì)胞凋亡率為(56.35±0.71)%，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。厄洛替尼+3-MA組細(xì)胞凋亡率明顯增加，為(78.40±0.52)%，與單用厄洛替尼組相比差異顯著(P<0.05)。

2.3AO檢測(cè)細(xì)胞自噬情況 AO可將胞質(zhì)內(nèi)酸性自噬泡染成紅色。單用3-MA組細(xì)胞胞核呈均勻綠色熒光，單用厄洛替尼組細(xì)胞胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈點(diǎn)片狀紅色熒光，由此可見該組細(xì)胞明顯發(fā)生自噬。3-MA與厄洛替尼聯(lián)合作用組較單用厄洛替尼組細(xì)胞相比，紅色熒光強(qiáng)度有所減少。說明3-MA可以抑制厄洛替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬現(xiàn)象。

2.4Western印跡結(jié)果 對(duì)照組、厄洛替尼組、3-MA組及厄洛替尼+3-MA組A549細(xì)胞Beclin1和Caspase9蛋白相對(duì)灰度值分別為0.54±0.03、0.86±0.03、0.37±0.02、0.70±0.04和0.43±0.03、0.77±0.03、0.57±0.04、0.90±0.02，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

肺癌治療目前以手術(shù)為主，包括放化療在內(nèi)的綜合治療方案已經(jīng)比較成熟，但其預(yù)后仍不理想；特別是中晚期失去手術(shù)機(jī)會(huì)的患者，無病生存率更差、更低〔9〕。近年來，以厄洛替尼為代表的靶向治療藥物在臨床上顯示出較好的療效，但后期耐藥又使得醫(yī)生束手無策。有關(guān)研究〔10～12〕顯示耐藥的機(jī)制與細(xì)胞自噬有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有雙重作用。作為腫瘤抑制機(jī)制，自噬可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或者減少腫瘤細(xì)胞的有害突變來防止腫瘤的形成；作為腫瘤保護(hù)機(jī)制，自噬可以通過保護(hù)癌細(xì)胞免受放射線的損害和化療藥物的作用來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存、轉(zhuǎn)移并增加其耐藥性。最近的研究表明，厄洛替尼抑制細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶活性可以誘導(dǎo)自噬〔13～15〕。

本研究結(jié)果表明，3-MA可以顯著增強(qiáng)厄洛替尼對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞株的殺傷作用。厄洛替尼可以誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞發(fā)生自噬，而3-MA與厄洛替尼聯(lián)合作用則降低了細(xì)胞的自噬水平。Caspase9是內(nèi)源性凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白酶，是Caspase家族中最重要的起始因子。流式細(xì)胞儀及Western印跡檢測(cè)結(jié)果亦支持以上結(jié)論。Beclin1是哺乳動(dòng)物Atg6的同源基因，一個(gè)與Bcl-2相互作用的蛋白，參與自噬泡的形成。結(jié)果顯示3-MA組Beclin1表達(dá)減少，厄洛替尼組顯著增加，而3-MA與厄洛替尼聯(lián)合作用組較單用厄洛替尼組表達(dá)明顯減少。綜合分析以上結(jié)果，厄洛替尼可以誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞株發(fā)生凋亡，并激活其自噬，而抑制自噬則可能通過激活內(nèi)源性凋亡通路來增強(qiáng)厄洛替尼的細(xì)胞殺傷作用。這些結(jié)果表明，自噬抑制劑可以增強(qiáng)厄洛替尼的抗腫瘤作用。因此，聯(lián)合使用自噬抑制劑和酪氨酸激酶抑制劑有可能成為克服臨床上耐藥問題的一個(gè)方向，且能增強(qiáng)酪氨酸激酶抑制劑厄洛替尼的效果。

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