馬寅仲，杜冠華

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院·北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，藥物靶點(diǎn)研究和新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

細(xì)胞分化伴隨著不可逆的譜系定型（lineage commitment），這一現(xiàn)象主要受表觀遺傳機(jī)制的調(diào)節(jié)。Davis等［1］通過對(duì)轉(zhuǎn)錄因子MyoD的調(diào)控突破了表觀遺傳的控制，從而將成纖維細(xì)胞重編程并分化為肌細(xì)胞。隨后Takahashi等［2］發(fā)現(xiàn)了只通過重編程4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（c-Myc、Oct3/4、Sox2、Klf4）便可以將人成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。此項(xiàng)技術(shù)的發(fā)明為體外建立人類疾病細(xì)胞模型的研究開啟了一扇新的大門。

最初的體細(xì)胞重編程技術(shù)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)［3］，但是由于c-Myc具有致癌性，且使用逆轉(zhuǎn)錄病毒本身也容易導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，這使得體細(xì)胞到iPSCs的重編程效率低下［4］。為了避免重編程過程中的基因修飾并提升獲取細(xì)胞的效率，人們采用避免整合外源基因到宿主基因的策略來優(yōu)化重編程技術(shù)。Stadtfeld等［5］在2008年首次使用腺病毒對(duì)大鼠肝細(xì)胞的Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子重編程得到iPSCs，因?yàn)橄鄬?duì)效率依舊不高，該方法并未得到廣泛的應(yīng)用。首個(gè)使用非整合型載體獲得iPSCs的方法是通過對(duì)大鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)的［6］，然而此方法操作繁瑣，且效率仍舊較低，因此仍未獲得廣泛使用。Yu等［7］在2009年報(bào)道了使用非整合游離型載體-仙臺(tái)病毒的重編程方法同樣得到了iPSCs，該方法所得iPSCs的核型與原體細(xì)胞的核型一致，且同樣具有分化為多種體細(xì)胞系的潛能。目前已有使用該種方法成功將人腎小管上皮細(xì)胞重編程并分化為βⅢtubulin（TUJ-1）陽性神經(jīng)元或GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的報(bào)道［8］。同樣類似的方法還有使用PiggyBac轉(zhuǎn)座子，在大鼠與人的成纖維細(xì)胞上均可以在不使用載體整合的情況下得到iPSCs［9］。隨后人們?cè)诜钦匣虻那疤嵯?，發(fā)現(xiàn)了一系列提高重編程效率的方法以進(jìn)一步提升細(xì)胞獲得效率，包括在重編程過程中加入小分子化合物以及與轉(zhuǎn)錄因子一并轉(zhuǎn)入miRNA簇等方法［10-11］。

使用具有基因缺陷類疾病的患者體細(xì)胞重編程得到iPSCs后，再通過誘導(dǎo)分化成為具有一定病理表型的特定細(xì)胞譜系，這種構(gòu)建體外疾病模型的方法被形容為“培養(yǎng)皿中的疾病”［12］。目前已有一系列應(yīng)用帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）、阿爾采末?。ˋlzheimer’s disease，AD）以及亨廷頓病（Huntington’s disease，HD）的患者體細(xì)胞在體外構(gòu)建具有病理特征神經(jīng)元的報(bào)道。本文分別從家族型與散發(fā)型兩個(gè)方面概括目前具有代表性的神經(jīng)退行性疾病的體外疾病模型的建立，并分析了其在新藥篩選中的應(yīng)用潛力。

1 以iPSCs構(gòu)建神經(jīng)退行性疾病細(xì)胞模型

神經(jīng)退行性疾病在病理上普遍以慢性進(jìn)行性神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能缺失為主要特征。至今人們已經(jīng)從多種神經(jīng)退行性疾病患者體細(xì)胞通過重編程得到iPSCs，主要包括PD、AD、HD以及肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateralsclerosis，ALS）等。

1.1 基于iPSCs的PD細(xì)胞病理模型構(gòu)建 PD是一種常見的神經(jīng)退行性疾病之一。其主要病理特征為腦內(nèi)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性退化與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)富含α-synuclein的包涵體（Lewy bodies）［13］。近年來對(duì)這些復(fù)雜病理表征從基因?qū)用孢M(jìn)行的解釋逐漸深入，目前已知的與PD發(fā)病直接相關(guān)的基因主要有 PARK2、SNCA、PARKIN、PINK1、DJ-1、UCHL1、LRRK2、PARK7、GBA、SNCAIP以及 ATP13A2［14-15］。在一項(xiàng)研究中，從具有3次 α-synuclein基因重復(fù)拷貝（SNCA）的PD患者體表獲取成纖維細(xì)胞，對(duì)其中部分細(xì)胞重編程為iPSCs，并誘導(dǎo)分化為中腦多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行體外培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者的成纖維細(xì)胞并未表達(dá)α-synuclein蛋白，而來自iPSCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的多巴胺能神經(jīng)元表達(dá)的α-synuclein蛋白量比該患者健康直系親屬iPSCs衍生出的多巴胺能神經(jīng)元所產(chǎn)生的蛋白量多出1倍以上［16］。其他一些研究也得出類似的結(jié)果，如取自PARKIN基因突變的PD患者體細(xì)胞重編程得到iPSCs后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的中腦多巴胺能神經(jīng)元由于單胺氧化酶A和B的表達(dá)高于正常細(xì)胞而使其對(duì)多巴胺的再攝取增加，進(jìn)而表現(xiàn)為明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)［17］。有趣的是，這種作用可以被腺病毒所轉(zhuǎn)入的PARKIN基因反轉(zhuǎn)。在另一項(xiàng)研究中，人們發(fā)現(xiàn)不論是家族型還是散發(fā)型PD，來源于二者的iPSCs分化所得多巴胺能神經(jīng)元均表現(xiàn)出了LRRK2轉(zhuǎn)錄活性的低下。從形態(tài)學(xué)角度觀察，與正常神經(jīng)元相比，所得神經(jīng)元的突起斷裂現(xiàn)象更多，突起分支減少，自噬現(xiàn)象也更為明顯［18］。

處于疾病晚期的神經(jīng)元亞型通常對(duì)基因背景十分敏感，因此應(yīng)用iPSCs在對(duì)此類模型的建立中存在一個(gè)明顯的限制因素，即該技術(shù)無法在確定的基因背景條件下開展實(shí)驗(yàn)，從而無法通過基因修復(fù)驗(yàn)證病理表型的變化。為了解決這個(gè)問題，Soldner等［19］通過將鋅指核酶（zinc finger nuclease，ZFN）介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)與iPSCs技術(shù)相結(jié)合，得到與疾病同源的基因組，并控制修正所得iPSCs系的兩個(gè)α-synuclein點(diǎn)突變易感基因，結(jié)果顯示，分化所得多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞的病理特征與未經(jīng)修正的細(xì)胞相比，其病理表征明顯的減輕。這種基因修復(fù)的方法也標(biāo)志著基因治療研究的重大進(jìn)展。

1.2 運(yùn)用iPSCs構(gòu)建AD體外細(xì)胞病理模型 AD是與年齡相關(guān)的最為常見的一種癡呆類型。由于人們對(duì)AD本身的發(fā)病機(jī)制缺乏了解，使得利用iPSCs建立AD模型與其他常見疾病相比更為復(fù)雜。AD以進(jìn)行性神經(jīng)元缺失結(jié)合Aβ淀粉樣蛋白，神經(jīng)纖維纏結(jié)（tau蛋白過度磷酸化）為主要的病理表征。盡管β淀粉樣蛋白前體蛋白（amyloidβprecursor protein，APP）由β分泌酶與γ分泌酶的酶解異常被認(rèn)為在AD發(fā)病中扮演一定角色，但AD的認(rèn)知功能障礙與蛋白沉積、多種異常折疊Aβ、tau蛋白過度磷酸化之間的關(guān)系仍不甚明了。

早老素（presenilin，PS）基因?yàn)槌Ｈ旧w顯性遺傳，其被認(rèn)為是早發(fā)型AD的誘因之一。在一項(xiàng)研究中，Israel等［20］選擇PS1與重復(fù)APP基因突變的家族型AD患者，以及兩種不同的散發(fā)型患者體細(xì)胞進(jìn)行重編程，得到相應(yīng)的iPSCs后誘導(dǎo)分化為皮層膽堿能神經(jīng)元。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種來自家族型及一種散發(fā)型患者的細(xì)胞均表現(xiàn)出Aβ1-40與Aβ1-42的明顯升高，且這種現(xiàn)象可被β分泌酶抑制劑，而不是γ分泌酶抑制劑特異性的阻斷。值得一提的是，所有的細(xì)胞均表現(xiàn)出正常膽堿能神經(jīng)元的電生理特性。Shi等［21］從唐氏綜合癥（down syndrome）患者體細(xì)胞重編程產(chǎn)生iPSCs，其3倍復(fù)制的21染色體中含有一段額外的APP基因拷貝。而且該iPSCs分化所得神經(jīng)元也表征出了Aβ以及tau蛋白過度磷酸化等AD早期病理特征。綜合分析，這些結(jié)果提示內(nèi)源性APP蛋白水解通路以及與其有關(guān)基因突變對(duì)tau蛋白過度磷酸化與aGSK3β水平升高具有直接的作用，從而成為AD發(fā)病的病理機(jī)制之一。最近一項(xiàng)研究中，Koch等［22］展示了來自PS1（L166P）突變的AD患者的iPSCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的膽堿能神經(jīng)元中γ分泌酶功能的部分缺失，這種現(xiàn)象進(jìn)而導(dǎo)致了Aβ40產(chǎn)量的降低，以及Aβ42/40比例的升高。非類固醇類抗炎藥物（nonsteroidalanti-inflammatorydrugs，NSAIDs）對(duì)這些神經(jīng)元樣細(xì)胞的γ分泌酶的調(diào)節(jié)作用也十分微弱。該患者iPSCs的研究提示針對(duì)AD藥物篩選的一個(gè)新靶點(diǎn)，以及在體外研究AD病理與人腦膽堿能系統(tǒng)的一個(gè)新的思路。

1.3 運(yùn)用iPSCs構(gòu)建HD細(xì)胞病理模型 HD是一種常染色體顯性神經(jīng)退行性疾病。它是由一個(gè)變異型亨廷頓基因（huntington gene），即一段過度擴(kuò)張的CAG三核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列所編碼的亨廷丁蛋白（huntingtin，htt）而引發(fā)的疾病［23］。該蛋白N端有1個(gè)拉長(zhǎng)伸展的谷氨酰胺序列，該序列使htt蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變從而在特定神經(jīng)元胞核附近聚集而產(chǎn)生毒性。

在過去很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，人們采用了多種不同的技術(shù)建立HD疾病模型，如采用人源的非神經(jīng)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞或淋巴母細(xì)胞），來自大鼠、小鼠或永生化的人源胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESCs））以及原代神經(jīng)元，這些模型可以再現(xiàn)HD的部分病理表征［24］。近年，來自轉(zhuǎn)基因HD猴子、大鼠和人類HD患者的iPSCs開始出現(xiàn)，使用該細(xì)胞系衍生的紋狀體神經(jīng)元與神經(jīng)前體細(xì)胞，具有與HD患者相同的CAG擴(kuò)張序列，并且對(duì)生長(zhǎng)因子缺乏表現(xiàn)出更強(qiáng)的凋亡活性［25］。來自HD猴子的iPSCs衍生的紋狀體神經(jīng)元可以在體外培養(yǎng)中觀察到其胞內(nèi)聚集的htt蛋白，隨著細(xì)胞的分化，還可見核包涵體的形成［26］。而使用R6/2轉(zhuǎn)基因HD大鼠成纖維細(xì)胞重編程得到的iPSCs中，CAG重復(fù)序列對(duì)細(xì)胞增殖活力，腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophi factor levels，BDNF）水平或神經(jīng)發(fā)生潛能均沒有明顯影響。除此之外，這些iPSCs在增殖與分化過程中也并未表現(xiàn)出凋亡活性的增加。另外，由于觀察到該HD大鼠體細(xì)胞中的一個(gè)溶酶體基因的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)上調(diào)，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)該iPSCs的溶酶體數(shù)量也出現(xiàn)了明顯的升高［27］。一項(xiàng)最近的研究進(jìn)一步證實(shí)了來自HD患者的iPSCs能夠在體外產(chǎn)生正常功能與亞型的神經(jīng)元，且在移植入成年大鼠腦內(nèi)之后仍具有分化神經(jīng)元的能力。但是，在該iPSCs所分化得到的星形膠質(zhì)細(xì)胞中觀察到胞內(nèi)大量空泡的產(chǎn)生，該現(xiàn)象也在患者體內(nèi)的淋巴母細(xì)胞中被觀察到［28］。以上結(jié)果提示，來自HD動(dòng)物與患者的iPSCs能夠在體外重現(xiàn)至少部分HD疾病的病理特征。對(duì)于該疾病的新靶點(diǎn)，可能存在于膽固醇代謝和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化有關(guān)通路之中，這對(duì)現(xiàn)有藥物的篩選具有新的指導(dǎo)意義。

1.4 構(gòu)建ALS細(xì)胞病理模型 ALS以肌萎縮和無力，伴隨快速進(jìn)行性的大腦與脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退行性病變?yōu)橹饕±硖卣鳎?9］。絕大多數(shù)病例為散發(fā)型（sALS），大約10%為遺傳型（fALS）。目前發(fā)現(xiàn)的有超過10個(gè)基因被認(rèn)為與ALS發(fā)病有關(guān)，包括超氧化物歧化酶1（SOD1、ALS1）、交換應(yīng)答DNA結(jié)合蛋白-43（TDP-43、ALS10）、融合肉瘤（FUS、ALS6）、靶面結(jié)合蛋白 B/C（VAPB、ALS8）、EPHA4受體等［30］?；贏LS動(dòng)物模型在實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)令人失望，建立新型ALS模型具有重要意義。

目前，已有4個(gè)研究小組成功的從3種不同家族型及1例散發(fā)型ALS患者體細(xì)胞獲取iPSCs。Dimos等［31］從SOD1突變的患者體細(xì)胞得到iPSCs，并確認(rèn)該細(xì)胞系具有ESCs的一些特性，并能夠分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。但是，與ALS相關(guān)的病理表現(xiàn)卻并未出現(xiàn)。Mitne-Neto等［32］通過與未患病直系親屬（空白對(duì)照組）相比，VAPB突變患者的iPSCs分化得到的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中VAPB蛋白水平明顯減少，提示VAPB可能與ALS8的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。該研究組進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)伴隨向神經(jīng)元的分化過程，空白對(duì)照組的VAPB呈逐漸增加，而ALS8突變組則未觀察到此現(xiàn)象，提示ALS8的突變可能是造成VAPB蛋白水平無法升高的原因之一。而空白對(duì)照與ALS8突變組的VAPBmRNA水平并未觀察到明顯差異，說明這種細(xì)胞對(duì)VAPB的調(diào)節(jié)作用似乎發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后階段。

帶有TDP-43突變的iPSCs能夠分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，且所得的突變神經(jīng)元表現(xiàn)出ALS的病理特征，如TDP-43蛋白的可溶性增加、細(xì)胞存活能力降低、對(duì)磷酸肌醇-3激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）通路抑制劑的敏感性明顯提升等等。Kassa等［33］使用散發(fā)型ALS患者獲得的 iPSCs分別誘導(dǎo)為上位與下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，也同樣觀察到了類似的病理特征。他們選擇TDP-43作為靶點(diǎn)，使用該ALS模型進(jìn)行高內(nèi)涵篩選，發(fā)現(xiàn)了包括地高辛在內(nèi)的一系列FDA批準(zhǔn)上市的小分子調(diào)節(jié)劑，具有降低該蛋白水平的作用。因此，研究患者iPSCs分化所得此類細(xì)胞的表型有助于發(fā)現(xiàn)ALS發(fā)病的新機(jī)制及新的藥物作用靶點(diǎn)。

2 iPSCs與HCS

HTS是一種廣泛用于早期藥物發(fā)現(xiàn)的篩選技術(shù)。目前隨著硬件與軟件技術(shù)的不斷進(jìn)步，HTS已經(jīng)可以結(jié)合具有亞細(xì)胞水平分辨率的顯微鏡，進(jìn)行細(xì)胞圖片分析與篩選技術(shù)，即HCS。與傳統(tǒng)的HTS技術(shù)相比，同樣的篩選速度，HCS能夠得到更多數(shù)據(jù)，如細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、膜完整性、靶點(diǎn)外效應(yīng)、細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)等等。

使用iPSCs進(jìn)行藥物篩選的成功案例是振奮人心的，其對(duì)于特定類型患者進(jìn)行小至中等數(shù)量的化合物藥效與毒性的評(píng)估是十分寶貴的。如何使iPSC技術(shù)在藥物研發(fā)與新藥發(fā)現(xiàn)的過程中發(fā)揮更重要的作用，關(guān)鍵在于能否更為系統(tǒng)全面地評(píng)價(jià)在化合物刺激后的分化細(xì)胞的病理表型變化。iPSCs不僅能夠攜帶特定突變，并具有確定的基因背景，與腫瘤細(xì)胞系相比其更能夠保留體細(xì)胞的關(guān)鍵特性與相對(duì)正常的胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，且保持低分化狀態(tài)的iPSCs還具備良好增殖活力，從而能夠不斷地提供篩選用細(xì)胞。

傳統(tǒng)HTS一次檢測(cè)僅能得到培養(yǎng)皿內(nèi)所有細(xì)胞某一靶點(diǎn)的信號(hào)之和，也就忽略了個(gè)體細(xì)胞反映的異質(zhì)性與靶點(diǎn)外的信息。這種方法雖然具有針對(duì)性，但卻因缺少形態(tài)學(xué)與靶點(diǎn)外的效應(yīng)而造成假陰性結(jié)果的激增。HCS能夠提供被觀察目標(biāo)在時(shí)間、空間與光譜范圍內(nèi)的變化。HCS是將HTS的多種測(cè)量指標(biāo)匯總輸出，得到化合物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的較全面生物學(xué)效應(yīng)的觀察［34］。從以上特點(diǎn)綜合分析，iPSCs更適合與HCS技術(shù)相結(jié)合，為每次篩選提供更多的化合物活性信息，大大減少了假陽性與假陰性的情況發(fā)生［35］。

3 使用iPSCs建立神經(jīng)退行性疾病模型中亟待解決的問題

盡管使用iPSCs建立神經(jīng)退行性疾病模型具有很好的發(fā)展前景，但在其應(yīng)用過程中仍有一些亟待解決的問題。在對(duì)許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病使用iPSCs進(jìn)行體外模擬時(shí)，我們?nèi)耘f無法觀察到典型的病理表型。從分子層面分析，與疾病相關(guān)蛋白與全基因的表達(dá)可以通過iPSCs在體外反映出來，但對(duì)于神經(jīng)退行性疾病晚期的病理表征，如PD患者多巴胺能神經(jīng)元胞內(nèi)的包涵體，使用患者體細(xì)胞所衍生出來的神經(jīng)元就無法表現(xiàn)。

另一個(gè)方面，鑒于這些細(xì)胞系的表型多樣性與患者的基因異質(zhì)性，對(duì)于來自單一患者衍生的iPSCs而言，實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性與數(shù)據(jù)的驗(yàn)證顯得尤為重要。因此可通過嘗試對(duì)所得iPSCs的基因缺陷進(jìn)行修復(fù)的方法，作為驗(yàn)證這些疾病模型可靠性的手段。

4 前景與展望

人源iPSCs技術(shù)用于疾病模型的建立發(fā)展迅速。最近的研究成果允許科學(xué)家們?cè)隗w外研究疾病病理表型，了解疾病狀態(tài)下細(xì)胞的微環(huán)境以及進(jìn)行新藥發(fā)現(xiàn)與藥物功能的測(cè)試。盡管重編程技術(shù)仍不夠成熟，但目前不斷破冰式的發(fā)展，已經(jīng)幫助學(xué)者們克服了許多曾經(jīng)無法解決的難題。iPSC技術(shù)為當(dāng)前的藥物發(fā)現(xiàn)提供了革命性的方法，它橋接了基因生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)與生理學(xué)［36］。

首例人源iPSCs細(xì)胞系的建立至今不過5年時(shí)間，因此更多的研究成果是十分值得我們期待的。iPSCs在發(fā)現(xiàn)新活性化合物與探索發(fā)病機(jī)制方面的優(yōu)勢(shì)仍需大量的工作來驗(yàn)證。目前人們對(duì)使用人源iPSCs在體外建立慢性與感染性疾病的熱情不斷升溫，相信在不久的將來，此項(xiàng)技術(shù)能為新藥篩選與疾病機(jī)制探索提供實(shí)質(zhì)性的幫助。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Davis R L，Weintraub H，Lassar A B.Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts［J］.Cell，1987，51：987-1000.

［2］ Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.Induction of pluripotent stem cells from adulthuman fibroblasts by defined factors［J］.Cell，2007，131：861-72.

［3］ Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotentstem cells from mouse embryonic and adult fibroblastcultures by defined factors［J］.Cell，2006，126：663-76.

［4］ Okita K，Ichisaka T，Yamanaka S.Generation ofgermline-competent induced pluripotent stem cells［J］.Nature，2007，448：313-7.

［5］ Stadtfeld M，Nagaya M，Utikal J，etal.Induced pluripotent stem cells generated without viral integration［J］.Science，2008，322：945-9.

［6］ Okita K，Nakagawa M，Hyenjong H，et al.Generation ofmouse induced pluripotent stem cells without viral vectors［J］.Science，2008，322：949-53.

［7］ Yu J，Hu K，Smuga-Otto K，et al.Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences［J］.Science，2009，324：797-801.

［8］ Wang L，Wang L，HuangW，et al.Generation of integration-free neural progenitor cells from cells in human urine［J］.Nat Meth-ods，2013，10（1）：84-9.

［9］ Woltjen K，Michael IP，Mohseni P，etal.PiggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells［J］.Nature，2009，458：766-70.

［10］Huangfu D，Maehr R，Guo W，et al.Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by smallmolecule compounds［J］.Nat Biotechnol，2008，26：795-7.

［11］Li Z，Yang C S，Nakashima K，et al.Small RNA-mediated regulation of iPS cell generation［J］.EMBO J，2011，30：823-34.

［12］Burkhardt M F，Martinez F J，Wright S，et al.A cellularmodel for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells［J］.Mol Cell Neurosci，2013，56：355-64.

［13］Lubbe S，Morris H R.Recentadvances in Parkinson′s disease genetics［J］.JNeurol，2013，［Epub ahead of print］.

［14］Byrd R A，Weissman AM.CompactParkin only：insights into the structure of an autoinhibited ubiquitin ligase［J］.EMBO J，2013，32（15）：2087-9.

［15］Grünewald A，Kasten M，Ziegler A，etal.Next-generation phenotyping using the parkin example：time to catch up with genetics［J］.JAMANeurol，2013，70（9）：1186-91.

［16］Devine M J，Ryten M，Vodicka P，et al.Parkinson’s disease induced pluripotent stem cells with triplication of the alpha-synuclein locus［J］.Nat Commun，2011，2：440.

［17］Jiang H，Ren Y，Yuen E Y，etal.Parkin controls dopamine utilization in human midbrain dopaminergic neurons derived from induced pluripotent stem cells［J］.Nat Commun，2012，3：668.

［18］Sanchez-Danes A，Richaud-Patin Y，Carballo-Carbajal I，et al.Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson′s disease［J］.EMBO Mol Med，2012，4（5）：380-95.

［19］Soldner F，Laganière J，Cheng AW，etal.Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson pointmutations［J］.Cell，2011，146（2）：318-31.

［20］Israel M A，Yuan SH，Bardy C，et al.Probing sporadic and familial Alzheimer’s disease using induced pluripotent stem cells［J］.Nature，2012，482（7384）：216-20.

［21］Shi Y，Kirwan P，Smith J，etal.A human stem cellmodel of early Alzheimer’s disease pathology in Down syndrome［J］.Sci Transl Med，2012，4（124）：124-9.

［22］Koch P，Tamboli IY，Mertens J，et al.Presenilin-1 l166p mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation［J］.Am JPathol，2012，180（6）：2404-16.

［23］Du X，Pang T Y，Hannan A J.A Tale of twomaladies pathogenesis of depression with and without the Huntington′s disease gene Mutation［J］.Front Neurol，2013，4：81.

［24］Kaye JA，F(xiàn)inkbeiner S.Modeling Huntington′s disease with induced pluripotent stem cells［J］.Mol Cell Neurosci，2013，56：50-64.

［25］Niclis JC，Pinar A，Haynes JM，et al.Characterization of forebrain neurons derived from late-onset Huntington′s disease human embryonic stem cell lines［J］.Front Cell Neurosci，2013，7：37.

［26］Camnasio S，Delli Carri A，Lombardo A，et al.The first reported generation of several induced pluripotent stem cell lines from homozygous and heterozygous Huntington′s disease patients demonstratesmutation related enhanced lysosomal activity［J］.Neurobiol Dis，2012，46（1）：41-51.

［27］Castiglioni V，Onorati M，Rochon C，et al.Induced pluripotent stem cell lines from Huntington′s disease mice undergo neuronal differentiation while showing alterations in the lysosomal pathway［J］.Neurobiol Dis，2012，46（1）：30-40.

［28］Juopperi T A，Kim W R，Chiang CH，etal.Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington′s disease patient cells［J］.Mol Brain，2012，5：17.

［29］Muyderman H，Chen T.Mitochondrial dysfunction in ALS-a valid pharmacological target［J］？Br JPharmacol，2013，［Epub ahead of print］.

［30］Ticozzi N，Tiloca C，Morelli C，et al.Genetics of familial Amyotrophic lateral sclerosis［J］.Arch Ital Biol，2011，149（1）：65-82.

［31］Dimos JT，Rodolfa K T，Niakan K K，et al.Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated intomotor neurons［J］.Science，2008，321（5893）：1218-21.

［32］Mitne-Neto M，Machado-Costa M，Marchetto M C，et al.Downregulation of VAPB expression in motor neurons derived from induced pluripotent stem cells of ALS8 patients［J］.Hum Mol Genet，2011，20（18）：3642-52.

［33］Kassa R M，Mariotti R，Bonaconsa M，et al.Gene，cell，and axon changes in the familial amyotrophic lateral sclerosismouse sensorimotor cortex［J］.JNeuropathol Exp Neurol，2009，68（1）：59-72.

［34］ Taylor D L.Past，present，and future of high content screening and the field of cellomics［J］.MethodsMol Biol，2007，356：3-18.

［35］Zanella F，Lorens JB，Link W.High contentscreening：Seeing is believing［J］.Trends Biotechnol，2010，28：237-45.

［36］俞海燕，吳文濤，王 薇，等.成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外向視網(wǎng)膜細(xì)胞的誘導(dǎo)分化［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2014，30（6）：787-91.

［36］Yu H Y，Wu W T，Wang W，et al.Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiate into retinal cells in vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，2014，30（6）：787-91.