黃 達(dá) 黃志萍 馮清春 胡少敏 曹桂芬 王興文 吳碧瑩 吳 懇 蘇春妮 孫 悅

(?？谑械谌嗣襻t(yī)院，海南 ?？?571100)

高血壓、心臟病、糖尿病、高血脂、高血黏度等因素通過(guò)影響血液成分變化及血流動(dòng)力學(xué)變化而導(dǎo)致血栓形成，發(fā)生腦梗死，而遺傳因素也是腦梗死發(fā)生的重要影響因素之一〔1～3〕。內(nèi)皮素(ET)是血管收縮性物質(zhì)，對(duì)調(diào)節(jié)心血管功能、維持基礎(chǔ)血管張力及心血管系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要作用。ET-1是迄今為止發(fā)現(xiàn)的收縮功能最強(qiáng)的內(nèi)源性物質(zhì)，其增高不僅與腦梗死的發(fā)病有關(guān)，與其發(fā)展過(guò)程也有密切關(guān)系〔4〕。遺傳多態(tài)性是影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及表達(dá)水平的重要因素，也是疾病發(fā)生的基礎(chǔ)。ET-1存在遺傳多態(tài)性，其中rs5370G/T是內(nèi)皮素前體蛋白198位氨基酸由賴氨酸突變?yōu)樘於０返亩鄳B(tài)位點(diǎn)。本研究擬探討該位點(diǎn)的突變是否與海南漢族老年腦梗死存在關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1一般資料 (1)對(duì)照組：無(wú)血緣關(guān)系的海南漢族健康個(gè)體156例，肝腎功能正常，排除糖尿病、心腦血管疾病、血液病史。對(duì)照組中男97例，女59例,年齡>60歲，平均68.7歲。(2)實(shí)驗(yàn)組：海南省漢族腦梗死患者150例，所有病例均經(jīng)頭部CT掃描確診為腦梗死，并且符合第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的“各類腦血管病診斷要點(diǎn)”中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。男92例，女57例，年齡>60歲，平均69.3歲。所有實(shí)驗(yàn)組患者均排除心源性腦栓塞、有嚴(yán)重先天性心、肝、腎和造血系統(tǒng)疾病者、合并惡性腫瘤患者。兩組患者年齡、性別比例及體重等一般體征無(wú)顯著差異，存在可比性(P>0.05)。

1.2基因多態(tài)性的檢測(cè) ①基因組DNA提?。核腥脒x者采集EDTA抗凝血3 ml，利用北京天根生化科技有限公司的TIANamp Genomic DNA Kit提取基因組DNA。②基因序列的獲得及引物設(shè)計(jì)：從GenBank中獲取人類ET-1編碼基因，并獲得rs5370的位點(diǎn)信息〔TTTCATGATCCCAAGCTGAAAGGCAA(G/T)CCCTCCAGAGAGCGTTATGTGACCC〕。根據(jù)以上信息在rs5370位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)兩個(gè)引物(P1:GTCGGAGACCATGAGAAACAG，P2:TCAGGAACCAGCAGAGGATGC)，引物擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為220 bp。③PCR擴(kuò)增體系及條件：每管在1×PCR緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2)中含模板DNA 0.2 μg,引物各0.2～0.5 μmol/L，4種dNTP各100 μmol/L,Taq DNA聚合酶(北京天根公司產(chǎn)品)1 U，擴(kuò)增體系為15 μl。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性3 min，之后進(jìn)行11個(gè)循環(huán)反應(yīng)(每個(gè)循環(huán)包括94℃ 15 s，60℃15 s)，循環(huán)完成后72℃溫育30 s，接著進(jìn)行24個(gè)循環(huán)反應(yīng)(每個(gè)循環(huán)包括94℃ 15 s，60℃15 s)，循環(huán)完成后72℃溫育3 min。④PCR產(chǎn)物的純化:PCR擴(kuò)增后取3 μl PCR產(chǎn)物用ExoI和FastAP純化。⑤SNP分型：利用延伸引物TTTTTTTTTATGATCCCAAGCTGAAAGGCAA進(jìn)行延伸反應(yīng)，取1 μl延伸產(chǎn)物，加8 μl上樣緩沖液，95℃變性3 min，立即冰水浴，上測(cè)序儀進(jìn)行分型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算。頻率比較用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

兩組中均可檢測(cè)出GG、GT、TT三種基因型，三種基因型在實(shí)驗(yàn)組中的分布頻率分別為79例(52.7％)、54例(36％)、17例(11.3％)，在對(duì)照組中的分布頻率分別為121例(68％)、47例(26.4％)、10例(5.6％)，組間基因型分布頻率存在明顯差異(χ2=8.79，P=0.012)。GG在實(shí)驗(yàn)組中的分布頻率明顯低于對(duì)照組(χ2=8.01，P=0.005)，而TT或者GT在組間的分布則無(wú)顯著差異 (P>0.05)。等位基因G和T在實(shí)驗(yàn)組的分布頻率分別為212例(70.7％)、88例(29.3％)，在對(duì)照組中的分布頻率分別為289例(81.2％)、67例(18.8％)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示組間差異顯著(χ2=9.97，P=0.001)。

3 討 論

ET對(duì)心血管系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要作用，而目前發(fā)現(xiàn)的三類ET中，ET-1被發(fā)現(xiàn)收縮功能最強(qiáng)。成熟的ET-1僅有21個(gè)氨基酸，是由含有200個(gè)氨基酸的巨大前體經(jīng)加工編輯而來(lái)。rs5370是ET前體分子中198位密碼子的多態(tài)性位點(diǎn)，該位點(diǎn)若為G則對(duì)應(yīng)的氨基酸為賴氨酸，若為T(mén)則對(duì)應(yīng)的是天冬酰胺。Raymond等〔5〕于2013年提出賴氨酸非共價(jià)修飾在機(jī)體正常生命過(guò)程中的重要性，認(rèn)為該修飾可能與機(jī)體的正常生命活動(dòng)密切相關(guān)，而賴氨酸的突變則可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。杭麗瑋等〔6〕探討了該位點(diǎn)與高血壓缺血性腦卒中的關(guān)系，結(jié)果顯示其基因型頻率和等位基因頻率在腦卒中組和對(duì)照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，基因型頻率的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析發(fā)現(xiàn)，GT+TT基因型患腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)是GG基因型的4.855倍。

本研究結(jié)果說(shuō)明，基因型GG可能是海南漢族老年人群心腦血管的保護(hù)因素，而等位基因T則可能是海南漢族老年人群腦梗死的易感基因。

4 參考文獻(xiàn)

1Ueda N,Satoh S,Kuroiwa Y. Multiple cerebral infarction and cardiomyopathy with pheochromocytoma〔J〕. The Neurologist,2011;17(1):34-7.

2楊發(fā)滿.老年腦梗死患者血栓調(diào)節(jié)蛋白及IL-6水平〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2013;33(18)：4573-4.

3李紅娟,李 慶.腦梗死患者相關(guān)危險(xiǎn)因素分析〔J〕.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2013;2:487-8,491

4劉靜波.急性腦梗死患者血漿內(nèi)皮素表達(dá)水平的臨床研究〔J〕.中華全科醫(yī)學(xué),2013;8:1329-30.

5Moellering RE,Cravatt BF. Functional lysine modification by an intrinsically reactive primary glycolytic metabolite〔J〕．Science，2013;341(6145)：549-53.

6杭麗瑋,周建中,王 珍,等.內(nèi)皮素-1基因多態(tài)性與高血壓缺血性卒中的關(guān)系〔J〕.西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009;1：116-21.