文│郭春燕（山西晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院）

迄今為止，畜禽育種工作已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)展，畜牧生產(chǎn)水平也得到了極大的提高。然而在20世紀(jì)90年代，由于畜禽選種理論和技術(shù)發(fā)展緩慢，導(dǎo)致了遺傳改良的速度也呈現(xiàn)了變慢的趨勢(shì)。正是在這一時(shí)期，隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的飛速發(fā)展，不斷提出了新的動(dòng)物育種方法。以分子數(shù)量遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)的動(dòng)物分子育種也應(yīng)運(yùn)而生。以基因組分析和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)為依托的分子育種技術(shù)是建立在對(duì)各種遺傳標(biāo)記不斷研究的基礎(chǔ)之上，本文就動(dòng)物分子育種的遺傳標(biāo)記發(fā)展情況作一概述。

一般來(lái)講，遺傳標(biāo)記是指可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征，即遺傳標(biāo)記是指一些等位基因或遺傳物質(zhì)，其表型易于識(shí)別且遵循孟德?tīng)栠z傳方式遺傳。遺傳標(biāo)記最早可以見(jiàn)于20世紀(jì)50年代的微生物遺傳研究領(lǐng)域。遺傳標(biāo)記的發(fā)展經(jīng)歷了形態(tài)和生理標(biāo)記，到細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記，再到后來(lái)的DNA分子標(biāo)記?？v觀遺傳學(xué)發(fā)展的歷史，每一種新型遺傳標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)，都大大推進(jìn)了遺傳學(xué)的發(fā)展，從而促進(jìn)了動(dòng)物育種實(shí)踐。

一、傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記

根據(jù)動(dòng)物能夠明顯顯示遺傳多態(tài)性的外觀性狀，如毛色、角形、耳形、冠形等可以作為品種特征的標(biāo)志。有些形態(tài)標(biāo)記由于與某些經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)聯(lián)，在育種學(xué)上還具有特殊的經(jīng)濟(jì)意義，如利用雞的矮小基因成功地培育了矮小型蛋雞。通過(guò)對(duì)不同物種染色體形態(tài)、數(shù)目和結(jié)構(gòu)的研究，發(fā)現(xiàn)了染色體變異以及各種異形染色體等都有其特定細(xì)胞學(xué)特征，可以作為一種遺傳標(biāo)記來(lái)測(cè)定基因所在的染色體及其相對(duì)位置。

免疫學(xué)標(biāo)記是以動(dòng)物的免疫特性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，主要包括紅細(xì)胞抗原、白細(xì)胞抗原和淋巴細(xì)胞抗原等。白細(xì)胞表面抗原類(lèi)型又稱為主要組織相容性復(fù)合體（MHC），它是由一系列緊密連鎖具有高度多態(tài)的基因座位所組成的一個(gè)遺傳區(qū)域。由于MHC在動(dòng)物機(jī)體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著極其重要的作用并與家畜疾病的抗性和易感性之間有著非常密切的關(guān)系，從而成為疾病抗性和易感性的重要候選標(biāo)記基因。20世紀(jì)50年代，許多科學(xué)家發(fā)現(xiàn)同一種蛋白質(zhì)（或酶）可具有多種不同的形式。同時(shí)，隨著凝膠電泳技術(shù)的發(fā)展和組織化學(xué)染色法的應(yīng)用，顯示蛋白質(zhì)多態(tài)性的帶型可以肉眼辨別，從而以生化遺傳學(xué)為基礎(chǔ)建立了生化遺傳標(biāo)記。

二、DNA標(biāo)記

DNA標(biāo)記是在20世紀(jì)70年代以后隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展而逐漸發(fā)展起來(lái)的，相對(duì)于傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記而言，它是一種新的以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，具有許多優(yōu)點(diǎn)。

一是由于是直接反映DNA分子水平上的變異，因而能對(duì)各發(fā)育時(shí)期的個(gè)體，各個(gè)組織、器官甚至細(xì)胞作檢測(cè)，既不受環(huán)境的影響，也不受基因表達(dá)與否的限制，為研究工作提供了極大的便利；二是DNA標(biāo)記的等位點(diǎn)變異水平比表型標(biāo)記豐富得多，即多態(tài)性很高，以致無(wú)須專(zhuān)門(mén)創(chuàng)造特殊的遺傳材料；三是其數(shù)量極大，幾乎是無(wú)限的，遍及整個(gè)基因組；四是DNA標(biāo)記對(duì)生物體通常沒(méi)有不良影響，也不影響生物性狀的表現(xiàn)，即表現(xiàn)為“中性”；五是多數(shù)DNA標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，能分辨所有的基因型。DNA標(biāo)記的這些特性，奠定了它具有廣泛應(yīng)用性的基礎(chǔ)。

1980年，Botstein等首先提出了DNA限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（RFLPs標(biāo)記）可以應(yīng)用于DNA多態(tài)性的研究。之后相繼出現(xiàn)了小衛(wèi)星DNA、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA標(biāo)記（RAPD標(biāo)記）、微衛(wèi)星DNA標(biāo)記、擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（AFLPs標(biāo)記）及單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（SNPs）等。根據(jù)DNA多態(tài)性檢測(cè)手段的不同，可將DNA標(biāo)記分為以下四類(lèi)。

1.基于DNA-DNA雜交的DNA標(biāo)記。這類(lèi)標(biāo)記的檢測(cè)是利用限制性內(nèi)切酶酶切及凝膠電泳分離不同個(gè)體的DNA分子后，用經(jīng)標(biāo)記的特異DNA探針與之雜交，經(jīng)放射自顯影或非同位素顯色技術(shù)來(lái)檢測(cè)DNA的多態(tài)性，其中主要包括RFLPs和小衛(wèi)星DNA。

RFLPs是指用限制性內(nèi)切酶切割不同個(gè)體基因組DNA后，含有同源序列的酶切片斷在長(zhǎng)度上的差異。造成RFLPs多態(tài)性的原因主要是點(diǎn)突變導(dǎo)致的限制性位點(diǎn)改變和基因順序重排（包括大的DNA片段缺失和插入）。與傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記相比，RFLPs標(biāo)記具有共顯性遺傳，穩(wěn)定性好，無(wú)表型效應(yīng)，數(shù)量大，不受年齡、性別、基因產(chǎn)物的影響等優(yōu)點(diǎn)；缺點(diǎn)是多態(tài)信息含量低，而且操作復(fù)雜，耗時(shí)耗力，成本高，并且對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求較高、需求量大。在構(gòu)建遺傳連鎖圖和基因定位研究中，RFLPs是應(yīng)用得較多的標(biāo)記之一。

許多生物體的DNA存在大量的串聯(lián)重復(fù)序列的高變異區(qū)。通常將以15～75個(gè)核苷酸為基本單元的串聯(lián)重復(fù)序列稱為小衛(wèi)星。小衛(wèi)星標(biāo)記產(chǎn)生的多態(tài)性是由同一座位上的串聯(lián)單元數(shù)量的不同產(chǎn)生的。由特定的DNA探針與小衛(wèi)星DNA序列雜交可產(chǎn)生類(lèi)似于人指紋的DNA指紋。DNA指紋圖具有多座位性，高變異性和簡(jiǎn)單而穩(wěn)定的遺傳等特點(diǎn)，但是由于其在基因組內(nèi)呈非隨機(jī)分布，故較少用于畜禽遺傳圖譜的構(gòu)建和育種實(shí)踐中。

2.基于PCR的DNA標(biāo)記。這類(lèi)標(biāo)記是在1985年聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)問(wèn)世以后才逐漸發(fā)展起來(lái)的。根據(jù)所用引物的特點(diǎn)，又將這類(lèi)DNA標(biāo)記分為隨機(jī)引物的PCR標(biāo)記和特異引物的PCR標(biāo)記兩類(lèi)，其中的典型代表分別是RAPD標(biāo)記和微衛(wèi)星DNA標(biāo)記。

RAPD標(biāo)記所用的引物長(zhǎng)度通常為9～10個(gè)堿基，大約只有常規(guī)PCR引物長(zhǎng)度的一半。由于引物較短，所以在PCR中必須使用較低的退火溫度，以保證引物能與模板DNA結(jié)合。此外，由于使用了較短的引物，其PCR易受條件的影響，結(jié)果的重復(fù)性較差。改變引物的結(jié)合位點(diǎn)，或者在擴(kuò)增范圍內(nèi)有突變都會(huì)導(dǎo)致單個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增產(chǎn)物的有或無(wú)。這就意味著RAPD技術(shù)所提供的只是一種顯性標(biāo)記，它不能區(qū)分從一個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增的DNA片斷是純合的（雙拷貝）還是雜合的（單拷貝）。

微衛(wèi)星又名簡(jiǎn)單重復(fù)序列或短串聯(lián)重復(fù)序列，指以2～6堿基為核心序列，串聯(lián)重復(fù)排列而成。由于核心序列的拷貝數(shù)不同而呈現(xiàn)高度多態(tài)性，廣泛隨機(jī)地分布于真核生物基因組中，在DNA序列中平均每6千堿基就可能出現(xiàn)一個(gè)微衛(wèi)星座位。微衛(wèi)星DNA分布廣泛，高度多態(tài)性，呈共顯性，易于自動(dòng)化分析，是一種理想的分子標(biāo)記。因此在制作DNA指紋圖，鑒定親緣關(guān)系，遺傳圖譜構(gòu)建，數(shù)量性狀座位定位，畜禽標(biāo)記輔助選擇和遺傳多樣性評(píng)估等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。隨著PCR技術(shù)及凝膠檢測(cè)方法的不斷發(fā)展和更新，微衛(wèi)星DNA標(biāo)記越來(lái)越受到研究者的青睞，并發(fā)展成為繼RFLPs標(biāo)記之后的第二代分子標(biāo)記。

3.基于PCR與限制性酶切技術(shù)相結(jié)合的DNA標(biāo)記。這類(lèi)標(biāo)記是以限制性酶切和PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，將兩種技術(shù)有機(jī)結(jié)合的DNA標(biāo)記，主要包括兩種：一種是先將樣品DNA用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，再對(duì)其酶切片斷有選擇地進(jìn)行擴(kuò)增，然后檢測(cè)其多態(tài)性，這種標(biāo)記稱為AFLPs標(biāo)記。另一種是先對(duì)樣品DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，再用限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切檢測(cè)其多態(tài)性，稱為CAPS標(biāo)記。

AFLPs是Zabeau等（1993）發(fā)明的一項(xiàng)DNA指紋技術(shù)，其原理是通過(guò)基因組DNA酶切片斷的選擇性擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)DNA酶切片斷的多態(tài)性。它是在RFLPs標(biāo)記和RAPD標(biāo)記的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，既有RFLPs標(biāo)記的可靠性，又有RAPD標(biāo)記的方便性。AFLPs標(biāo)記所需DNA量少，不需Southern雜交，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性強(qiáng)，呈現(xiàn)典型的孟德?tīng)栠z傳，每個(gè)AFLPs反應(yīng)可以檢測(cè)的位點(diǎn)多達(dá)50～100個(gè)，多態(tài)性強(qiáng)，非常適合遺傳多樣性的分析。利用AFLPs進(jìn)行畜禽的遺傳變異研究和構(gòu)建基因組圖譜是十分理想的，不過(guò)AFLPs技術(shù)需要同位素進(jìn)行檢測(cè)，費(fèi)用較高，而且對(duì)技術(shù)人員要求也高，所以也有其不足之處。

4.基于單核苷酸多態(tài)性的DNA標(biāo)記。研究DNA水平上多態(tài)性的方法很多，其中最徹底最精確的方法就是直接測(cè)定某特定區(qū)域的核苷酸序列并將其相關(guān)基因組中對(duì)應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列進(jìn)行比較，由此可以檢測(cè)出單個(gè)核苷酸的差異。SNPs正是基于這個(gè)基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的。

SNPs是指基因組中單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入及缺失等形式。在動(dòng)物基因組中平均每300～500個(gè)堿基對(duì)中即可發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNPs。在家畜基因組中，SNPs位點(diǎn)同樣存在。因此可在較小的DNA區(qū)段構(gòu)建包括多個(gè)SNPs的單倍型，構(gòu)建的單倍型所呈現(xiàn)的等位基因數(shù)最大值為2n（n為所含SNPs座位數(shù)），從而克服了單個(gè)SNPs標(biāo)記信息含量不足的缺陷。SNPs具有高密度，分布廣，多態(tài)信息含量大，易于檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)分析等優(yōu)點(diǎn)，能較好用于基因圖譜和數(shù)量性狀基因座（QTL）定位研究，被譽(yù)為繼第二代分子標(biāo)記微衛(wèi)星標(biāo)記之后的第三代分子標(biāo)記，已經(jīng)在人的基因定位和人類(lèi)疾病相關(guān)基因及藥物設(shè)計(jì)研究中得到了廣泛的應(yīng)用，相信在動(dòng)物基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上SNPs具有廣闊的應(yīng)用前景。

三、DNA分子遺傳標(biāo)記的未來(lái)

從傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記到現(xiàn)代DNA分子遺傳標(biāo)記的發(fā)展過(guò)程，伴隨著人們對(duì)遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)DNA認(rèn)識(shí)的不斷深化，而遺傳學(xué)理論上任何可能的技術(shù)突破都為動(dòng)物育種新技術(shù)的產(chǎn)生提供了契機(jī)，通過(guò)將現(xiàn)代分子遺傳學(xué)與數(shù)量遺傳學(xué)結(jié)合產(chǎn)生的分子數(shù)量遺傳學(xué)也將為進(jìn)一步提高選種的準(zhǔn)確性和前瞻性貢獻(xiàn)力量。然而，不可否認(rèn)的是，我們依然基本上還是處在常規(guī)育種的時(shí)代，傳統(tǒng)的雜交育種理論依然是育種的主要理論基礎(chǔ)，分子育種的技術(shù)體系還需要不斷深化和完善。而且，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇理論指導(dǎo)的分子育種技術(shù)（即各種遺傳標(biāo)記的檢測(cè)技術(shù)）還需要在操作的簡(jiǎn)便性、成本、安全性等方面進(jìn)一步完善，也只有這樣才能在動(dòng)物育種實(shí)踐中實(shí)現(xiàn)其深遠(yuǎn)的影響。