王金丹，張寶善，李亞武，林敏，崔田田，馮亞運

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119）

醋酸菌耐酸機制的研究進展

王金丹，張寶善*，李亞武，林敏，崔田田，馮亞運

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119）

文章主要從醋酸菌的ABC轉(zhuǎn)運子、質(zhì)子動力勢外排泵、乙酸過氧化反應(yīng)和基因與酶調(diào)控等方面闡述了醋酸菌耐乙酸的機理，這對進一步認(rèn)識醋酸菌，尋找適合生產(chǎn)高酸度食醋的發(fā)酵菌種及高效生產(chǎn)食醋有很好的指導(dǎo)意義。

醋酸菌；耐酸性；機制；食醋

醋酸菌（acetic acid bacteria）即醋酸細菌，是一大類革蘭氏陰性、嚴(yán)格需氧菌。醋酸菌廣泛用于食品工業(yè)，特別是食醋的釀造，我國有文字記載的谷物醋釀造歷史已有3 000多年，最早在1868年人們就已經(jīng)確定醋酸菌是釀造食醋的主要微生物[1]，1894年就有關(guān)于醋酸菌的分類報道[2-3]。醋酸菌廣泛分布在果園的土壤中、葡萄或其他漿果或酸敗食物表面，以及未滅菌的醋、果酒、啤酒、黃酒中[4]。大多數(shù)醋酸菌（除Asaia）在氧氣充足的情況下，均可以直接將酒精氧化成乙酸[5-6]。在食醋生產(chǎn)中，乙酸是抑制醋酸菌產(chǎn)酸的關(guān)鍵因素。有些醋酸菌不耐酸，如Asaia和Saccharibacter[7-8]；有些醋酸菌則具有較高的耐酸能力，如Gluconacetobacter europaeus、Ga.intermedius、Ga.oboediens和Ga.entanii，耐酸質(zhì)量濃度從8 g/100 mL到10 g/100 mL不等[9-13]，而傳統(tǒng)自然發(fā)酵的食醋中的優(yōu)勢菌和主要菌Acetobacter aceti和Acetobacter pasteurianus的耐酸能力介于這兩者之間，最高耐酸濃度可達6%vol[14]。日本的正井博之成功的分離了在酸度100 g/L以上還能繼續(xù)繁殖產(chǎn)酸的醋酸菌Acetobacter polyoxogenessp.nov[15]。

通常認(rèn)為，醋酸質(zhì)量濃度＞0.5 g/100 mL時，就會對細菌細胞產(chǎn)生毒素。其原因是未解離的親脂性分子會穿過細胞膜滲透到細胞中，細胞內(nèi)分子的解離致使更多的醋酸根離子產(chǎn)生，細胞內(nèi)的pH值下降，破壞了跨膜質(zhì)子梯度和產(chǎn)物代謝的解偶聯(lián)[16]。在醋酸發(fā)酵后期，乙酸質(zhì)量濃度較大，由于過量乙酸的作用，醋酸菌氧化乙醇生成乙酸的能力和對乙酸的抗性都會減弱甚至喪失，致使醋酸積累量不足。醋酸菌耐酸的生化機制引起了許多研究者的濃厚興趣，因為研究醋酸菌耐酸的機理對于提高食醋生產(chǎn)工業(yè)的產(chǎn)量和探究微生物抵抗不良環(huán)境的生命機制均有重要的理論和實際意義。一直以來，科研重點都是放在醋酸菌對乙醇氧化的分子機制研究[17]，已經(jīng)確定醋酸菌是通過與膜結(jié)合的乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）以及輔酶氧化酶的復(fù)合體作用，把乙醇氧化為乙酸。而另一方面，對醋酸菌的耐酸機理研究較為多元，暫時沒有形成完整的體系[18]。本文就幾種具有代表性的耐酸機理作以介紹。

1 醋酸菌耐酸機理

研究顯示，醋酸菌耐酸的生化機理是十分復(fù)雜的，醋酸菌從生理上有兩個不同的抗酸階段：（a）氧化乙醇成乙酸的乙醇氧化階段；（b）氧化乙酸成CO2和H2O的過氧化階段[19]。這兩個階段由于代謝途徑和產(chǎn)物的不同，具有不同的耐酸機制。

1.1 ABC轉(zhuǎn)運子機制

NAKANO S等[20]通過對A.aceti膜部分二維凝膠電泳分析，研究A.aceti的耐酸性與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)醋酸能誘導(dǎo)產(chǎn)生一種60 ku的蛋白質(zhì)（aatA），它由591個氨基酸組成，含有三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）連接盒式序列（ATP-binding cassette，ABC）和ABC標(biāo)記信號序列，屬于ABC轉(zhuǎn)運家族。aatA被歸類為一種B型ABC轉(zhuǎn)運子[21]，因為它包含由一個單一的多肽串聯(lián)的兩個ABC單元，經(jīng)比較，aatA沒有顯示出與已知的幾個一元羧酸的轉(zhuǎn)運子的氨基酸序列具有顯著的相似性[22]，但與作為抗生素藥物外排泵的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的轉(zhuǎn)運子[23-24]具有共同的結(jié)構(gòu)[25]，這表明aatA可能與它有相同的功能。aatA基因的突變和過度表達影響著菌體對甲酸、乙酸和丙酸的耐受性，但在突變體與親本中觀察到了同樣的乙酸吸收轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。這些結(jié)果證實aatA的功能可能是作為乙酸的外排泵[20]。

在aatA的基因編碼區(qū)插入新霉素抗性基因后，aatA基因缺陷突變株耐甲酸、乙酸、丙酸和乳酸的性能降低，但是突變株在低pH環(huán)境中（由乙酸調(diào)節(jié)）生長對檸檬酸、赤霉素的抗性都沒有影響。然而，破壞或刪除兩個ABC之間的區(qū)域卻導(dǎo)致菌體耐酸性降低[26]。在突變體中，新霉素抗性基因模塊整合在的ABC區(qū)域的后半塊，ABC的前半?yún)^(qū)域和域間區(qū)域是完整的。這說明可能在突變體中aatA尚未完全失活。將含有aatA基因的質(zhì)粒pABC101（受E.colilae操縱子控制）插入aatA缺陷突變株中，可恢復(fù)對其乙酸的抗性。另外，大腸桿菌中存在該pABC101，也可增加耐酸性[26]。這些研究結(jié)果表明，aatA是一個與細菌耐酸性的有關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運子。A.aceti含有多拷貝質(zhì)粒aatA使發(fā)酵終乙酸產(chǎn)量增加。使用Southern印跡分析和核苷酸測序檢測aatA同源基因，證實其廣泛存在于多種醋酸菌中。

值得注意的是，aatA基因缺陷突變體的耐酸表型顯示，在A.aceti中aatA涉及耐乙酸、甲酸、丙酸和乳酸。這表明aatA對這些酸都可識別，含aatA表型的大腸桿菌也證實了這個觀點。但由于aatA突變體引起上述幾種酸中耐乙酸性的嚴(yán)重降低，可以認(rèn)為，aatA對乙酸識別最靈敏[20]。同時，由于細胞內(nèi)需要維持一個較低的乙酸濃度水平，過量的aatA導(dǎo)致乙酸濃度增長速率緩慢和乙酸最終產(chǎn)量的增加。

1.2 質(zhì)子動力勢外排泵機制

CHINNAWIROTPISAN P等[17]觀察到，A.pasteurianus中的乙醇脫氫酶（ADH）活性降低導(dǎo)致菌體對乙酸抗性降低。由于ADH的缺乏導(dǎo)致乙醇氧化中斷，推測菌體耐乙酸性降低可能與通過輔酶氧化酶作用過程中產(chǎn)生的質(zhì)子動力有關(guān)[27]。MATSUSHITA K等[28]推斷最有可能的耐酸性機制是A.aceti中存在位于胞質(zhì)膜的乙酸外排泵，使細胞在高濃度乙酸環(huán)境下生長時從細胞內(nèi)泵出乙酸。轉(zhuǎn)運活性依賴于pH值，不是ATP，因此外排泵依賴質(zhì)子動力，對質(zhì)子解偶聯(lián)劑敏感。雖然該理論中具有活性的轉(zhuǎn)運蛋白還沒有確定，但是可以認(rèn)定，他們所發(fā)現(xiàn)的外排泵機制與aatA不同。

通過在醋酸菌A.aceti（IFO3283）中增加另外的質(zhì)子解偶聯(lián)劑及氰化物，可使乙酸/乙酸鹽在菌體細胞中積累，表明菌體中存在著依賴能量的外排系統(tǒng)。而膜兩側(cè)囊泡在添加呼吸底物后，內(nèi)側(cè)囊泡乙酸/乙酸鹽的積累量高于外側(cè)，說明在這兩種類型的膜囊泡均對質(zhì)子的解偶劑敏感，而內(nèi)側(cè)膜泡對乙酸/乙酸鹽的攝取不依賴于ATP，而依賴質(zhì)子動力[28]。通過該實驗得出的結(jié)論，A.aceti擁有一個質(zhì)子動力依賴的乙酸外排泵。在菌體細胞中，通過乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）的催化作用，乙醇氧化產(chǎn)生乙酸，同時提供一個電子到氧化酶輔酶端，形成質(zhì)子動力。借助質(zhì)子動力勢，胞內(nèi)乙酸可以通過外排泵泵出細胞。

A.aceti的ISO膜囊泡降低pH值時，乳酸依賴型乙酸/乙酸鹽攝取比例增加。由于乳酸氧化酶活性的最適pH值為6.5，在較低的pH值時，高氧化率似乎與能量產(chǎn)生速率并無關(guān)系。這一結(jié)果表明，乙酸是由囊泡運輸，該外排泵盡管同樣作用于高濃度的短鏈羧酸，如丙酸、丁酸等，但其具有乙酸特異性。

由于該外排泵不能作用于乙醇，且與酵母細胞中轉(zhuǎn)運乙酸陰離子的典型ABC轉(zhuǎn)運子Pdr12也有較大差異，認(rèn)為該乙酸外排泵為H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，而不是ABC轉(zhuǎn)運子[28]。乙酸泵送出的是“質(zhì)子”醋酸，維持了醋酸菌細胞內(nèi)的低乙酸環(huán)境。

1.3 乙酸過氧化機制

除了氧化乙醇為乙酸，A.aceti和Gluconacetobacter還可以進一步通過三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）循環(huán)和乙醛酸循環(huán)將乙酸氧化成CO2和水，這種現(xiàn)象稱為醋酸過氧化[29]。MATSUSHITA K等認(rèn)為A.aceti在乙醇培養(yǎng)基中的生長可以分為三個階段。第一階段，A.aceti完全氧化乙醇成乙酸，菌體生長（酒精氧化階段），第二階段，菌體停止生長，有大量活細胞，但數(shù)量逐漸下降（穩(wěn)定階段），第三階段，菌體利用乙酸過氧化重新生長（乙酸過氧化階段）。三個階段醋酸菌均表現(xiàn)出耐乙酸性[6，17，28]。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中存在乙醇或其他有效碳源時，醋酸菌優(yōu)先氧化乙醇或其它碳源。當(dāng)培養(yǎng)基中所有的有效碳源和能量被耗盡時，只剩下醋酸菌在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的醋酸時，處在穩(wěn)定期的醋酸菌開始氧化醋酸作為有效碳源和能源[29]。乙酰-輔酶A（coenzyme A，CoA）合成酶被激活，呼吸鏈中的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（triphosphopyridine nucleotide，NADPH2）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH2）的活性增強，從而使培養(yǎng)基中的乙酸在酶的作用下生成乙酰-CoA進入三羧酸循環(huán)，進一步徹底氧化成CO2和H2O[6]。在這個過程中，乙酰-CoA合成酶數(shù)量增加，同時在細胞利用乙酸時，異檸檬裂合酶和蘋果酸合成酶的活性增強。乙酸在乙酰-CoA合成酶的作用下，轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA，使乙酸進入到TCA和乙醛酸循環(huán)中，保證細菌生長環(huán)境的低酸性[30]。

1.4 基因與酶調(diào)控機制

為了分析A.aceti耐酸性，在不考慮過氧化現(xiàn)象[31]的情況下分離出對乙酸敏感的突變體[32-33]，并對由醋酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)組進行分析，檢測其與耐酸性有關(guān)的基因和酶。

通過N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍誘變，分離純化五株對醋酸敏感的A.aceti突變株。組成突變體的重組質(zhì)粒是從大腸桿菌使用載體pMVC1從親本株的染色體DNA基因庫分離出來的。檢測證明5個突變體的耐乙酸性均來源于其中的一個質(zhì)粒（pAR1611）中約30 kb的片段，亞克隆實驗進一步將其有效片段長度縮短到8.3 kb。為了識別插入失活的突變位點和參與耐酸性的基因，插入卡那霉素抗性基因到已克隆的8.3 kb的PstI片段并成功整合到親本株的染色體中。結(jié)果表明，至少需要三個基因賦予菌體耐乙酸性，命名為aarA、aarB、aarC[32]。

這些aar基因在自然突變的A.aceti（No.1023）菌株中共同缺失時耐酸性消失。基因aarA的序列與E.coli及其他菌中的檸檬酸合成酶（citrate Synthetase，CS）基因序列有很高的同源性。在A.aceti的aarA基因缺陷突變體中沒有發(fā)現(xiàn)CS活性，而通過引入含有aarA基因的質(zhì)粒，CS活性恢復(fù)。大腸桿菌的CS基因缺陷突變體在加入aarA基因后檢測到了CS活性。這些結(jié)果表明，aarA是編碼CS的基因?；騛arC編碼492個氨基酸的蛋白質(zhì)，它與Neurospora crassa acu-8基因產(chǎn)物有明顯的相似性。A.aceti的aarC基因缺陷突變體對乙酸的抗性和利用乙酸的能力明顯下降，將aarC基因?qū)牒?，這兩種功能會恢復(fù)。TCA循環(huán)中aarC取代琥珀酰-CoA合成酶，使琥珀酰-CoA直接轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA，這個新支路出現(xiàn)后可以減少對游離CoA的代謝需求，調(diào)節(jié)TCA循環(huán)對胞質(zhì)pH值的影響[34]。推定aarB基因是編碼已知的TCA激活劑SixA。由于醋酸從A.aceti胞內(nèi)到胞外不能被動進行，CO2的缺乏則允許乙酸不經(jīng)底物水平磷酸化排出。當(dāng)胞內(nèi)乙酸濃度需要降低時，這三個aar基因協(xié)同作用，形成了一個不同于傳統(tǒng)TCA的完整循環(huán)[32-34]。

CS和順烏頭酸酶作為TCA循環(huán)的限制酶，激活TCA循環(huán)和乙醛酸循環(huán)，轉(zhuǎn)化對細胞有毒害的乙酸，使細胞內(nèi)乙酸的質(zhì)量濃度維持在一個較低的水平。而CS在菌體耐酸性中的作用可能是直接通過三羧酸循環(huán)或乙醛酸循環(huán)轉(zhuǎn)化乙酸。另一種解釋是CS不與耐酸性直接相關(guān)，只簡單地為三羧酸循環(huán)提供足夠的ATP，提供菌體的耐酸機制所需的能量，減輕酸對細胞的毒害作用[32]。同時，研究顯示，順烏頭酸酶的活性隨著乙酸量增多顯著提高，通過多拷貝質(zhì)粒擴增順烏頭酸酶基因，A.aceti提高了酶的活性和耐乙酸性，還可減少菌體生長時間和產(chǎn)生較高質(zhì)量濃度的乙酸。這些結(jié)果都表明，順烏頭酸酶也與耐乙酸性有關(guān)[34]。

對自發(fā)的突變株分析顯示，菌體的ADH和ALDH活性與耐酸性密切相關(guān)[35]。A.acetic和A.pasteurianus在酸性條件下發(fā)生自然突變后，與膜連結(jié)的ADH酶活性降低或喪失。CHINNAWIROTPISAN P等[17]發(fā)現(xiàn)A.pasteurianus的ADH的基因破壞后，醋酸菌耐酸性喪失。從A.pasteurianus SKU1108中通過N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）誘變構(gòu)建吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）-ADH缺失突變體。PQQ-ADH缺陷突變體在乙醇培養(yǎng)基上培養(yǎng)的初始階段，培養(yǎng)液中的乙醇滲透進該突變體細胞質(zhì)中，誘導(dǎo)NAD依賴型ADH氧化乙醇。隨后以氧化產(chǎn)生的乙醛作為底物，經(jīng)NADP依賴性ALDH氧化成醋酸[36]。最后，醋酸在細胞質(zhì)中積累，通過乙酰輔酶A合成酶或乙酸激酶轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，經(jīng)TCA或乙醛酸循環(huán)代謝。實驗證實，參與細胞內(nèi)醋酸調(diào)節(jié)為NAD-依賴型ADH，通過TCA或乙醛酸循環(huán)調(diào)節(jié)[17，37]。而較高的ADH和ALDH活性則可以促進菌體產(chǎn)酸，此研究結(jié)果已廣泛應(yīng)用于果醋工業(yè)生產(chǎn)中[38]。

2 結(jié)語與展望

由于醋酸菌基因突變的高頻性，醋酸菌還可根據(jù)其在發(fā)酵過程中是否生成薄膜多糖分為S和R型。實驗證明，產(chǎn)薄膜多糖的R型菌比S型菌更耐乙酸，推測可能是因為薄膜多糖的存在導(dǎo)致了菌體具有突出的耐酸性[23]。LASKO D等[39]比較了A.aceti和Ga.oxydans對酸作用的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)8種特殊性應(yīng)激蛋白（acute phase response，APS）均與菌體的抗酸性有關(guān)。STEINER P等[40]研究了A.aceti的耐酸性與乙酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的50種蛋白質(zhì)有關(guān)。A.aceti的細胞產(chǎn)物甲?；?輔酶A：草酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶和草酰-CoA共同作用于菌體內(nèi)質(zhì)子脫羧過程，提高了菌體耐酸性[24]。另外，醋酸導(dǎo)致細胞形態(tài)發(fā)生變化，由原來的短圓形變成長條型，減少乙酸被動擴散進入細胞的有效面積[14]。

通過上述分析，認(rèn)為醋酸菌的耐酸機制可分兩種，一種以菌體細胞的膜蛋白為載體，通過消耗能量將乙酸轉(zhuǎn)運出細胞，維持了胞內(nèi)的低乙酸水平；另一種主要以相應(yīng)的代謝反應(yīng)為基礎(chǔ)，加以基因和酶調(diào)控，使乙酸分解成其他小分子物質(zhì)。以后也應(yīng)當(dāng)從這兩個方向進行延伸，進一步探究基因、酶和膜蛋白的作用機理。

綜上所述，盡管最近幾年在醋酸菌耐酸機制研究方面取得了許多進展，但是醋酸菌耐酸的生化機制是十分復(fù)雜的，不僅受多基因控制，還受多種物質(zhì)參與的多機制交叉調(diào)節(jié)。當(dāng)前，對該方向的研究僅僅是冰山一角，其復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)有待深入研究。通過研究，進一步對醋酸菌耐酸機制的了解，醋酸菌耐酸基因以及功能與基因質(zhì)子泵及相關(guān)基因機制的深入研究，勢必推動該菌深度利用和開發(fā)，具有廣泛的理論價值和應(yīng)用價值。

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Research progress on acid resistance mechanism of acetic acid bacteria

WANG Jindan,ZHANG Baoshan*,LI Yawu,LIN Min,CUI Tiantian,FENG Yayun
(College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi'an 710119,China)

This article mainly introduced several typical acid resistance mechanisms of the acetic acid bacteria.They were ABC transporter mechanisms,proton motive force-dependent efflux pump mechanisms,acetic acid peroxidation mechanisms,gene and enzyme regulatory mechanisms.The results provided good guiding significance in further understanding acetic acid bacteria,finding suitable high acidity production strains and high efficiency vinegar production.

acetic acid bacteria;acid resistance;mechanism;vinegar

TS264.2

A

0254-5071（2014）11-0010-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.003

2014-09-17

科技部農(nóng)業(yè)成果推廣項目（2011GB23600017）；陜西省教育廳科研計劃項目（12JK0818）

王金丹（1991-），女，碩士研究生，研究方向為微生物發(fā)酵技術(shù)。

*通訊作者：張寶善（1968-），男，教授，博士，研究方向為食品微生物及食品發(fā)酵。