吳先帆，崔艷華

（哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱150090）

0 引 言

近年來，隨著人們對(duì)微生物益生作用的認(rèn)識(shí)日益提高，越來越多的乳酸菌被利用于食品和醫(yī)療領(lǐng)域中。不同種類的乳酸菌生長(zhǎng)在不同的環(huán)境條件下，并且廣泛分布與自然界中。人類和動(dòng)物體內(nèi)、奶制品及一些植物的表面都存在這不同類型的乳酸菌。

低溫環(huán)境中的乳酸菌在工業(yè)生產(chǎn)有著重要的作用，因此研究乳酸菌在低溫環(huán)境中的抗凍機(jī)制，有助于優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵劑和發(fā)酵乳制品在工業(yè)生產(chǎn)中冷凍、發(fā)酵和儲(chǔ)藏條件，然而人們對(duì)于低溫環(huán)境中的乳酸菌的研究和利用并不充分。本文主要從乳酸菌的生物學(xué)特性著手，闡述目前乳酸菌的抗凍機(jī)制及其在低溫環(huán)境中抗凍能力的測(cè)定。

1 乳酸菌的抗凍機(jī)制

目前，人們對(duì)大腸桿菌的冷凍刺激反應(yīng)及其適應(yīng)性已有較為深入的研究，而對(duì)乳酸菌這方面的研究卻很少。乳酸菌在冷凍過程中的生理結(jié)構(gòu)主要發(fā)生以下變化：（1）低溫環(huán)境下，細(xì)胞膜的流動(dòng)性下降；（2）低溫環(huán)境下，乳酸菌的DNA和RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)受到影響，從而影響DNA的復(fù)制以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率[1]。具體論述如下。

1.1 低溫誘導(dǎo)合成冷誘導(dǎo)蛋白（CIP）

細(xì)菌在低溫環(huán)境下會(huì)發(fā)生冷激反應(yīng)，此時(shí)細(xì)胞的冷誘導(dǎo)蛋白（Cold-induced protein,CIP）量會(huì)增多。冷誘導(dǎo)蛋白的合成主要是通過以下途徑改善細(xì)胞對(duì)低溫的適應(yīng)能力，（1）增加短鏈或者不飽和脂肪酸的比例進(jìn)而改善細(xì)胞膜的流動(dòng)性；（2）通過降低負(fù)超螺旋，增加DNA超螺旋；（3）提高轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率。

雙向電泳分析表明，經(jīng)過冷刺激后，舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis） CB1、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） 20B、短乳桿菌（Lactobacillus brevis） H12菌株中分別有14個(gè)、18個(gè)和13個(gè)蛋白表達(dá)量提高[2]。乳酸乳球菌乳脂亞種MG1363菌株受到冷刺激后，一些涉及翻譯加工、糖代謝、染色體結(jié)構(gòu)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)蛋白被誘導(dǎo)[3,4]。Lactococcus piscium CNCM I-4031菌株在受到冷刺激后一些基礎(chǔ)壓力蛋白以及糖酵解、脂肪酸合成、能量代謝相關(guān)的蛋白表達(dá)發(fā)生了明顯變化，其中包括壓力蛋白DbaK、UspA；糖酵解蛋白Fba、GAPDH、Pgk；脂肪酸代謝蛋白FabH、FabF、FabG等等[5]。

冷激蛋白（Cold shock protein,CSP）是重要的冷誘導(dǎo)蛋白，可以作為陪伴分子與RNA通過非特異性相結(jié)合，可抑制mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，使低溫環(huán)境下的轉(zhuǎn)錄和翻譯得以正常進(jìn)行[6]。CSP最早在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，在乳酸菌各個(gè)種中也有所發(fā)現(xiàn)[7]，并且乳酸菌不同種及其亞種之間的CSP基因數(shù)目不盡相同[8]。嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）PB18和CNRZ302菌株中分別含有1個(gè)和6個(gè)CSPs[9,10]。Bolotin等對(duì)乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403全基因組序列分析表明其含有2個(gè)CSP基因:cspD和cspE[11]。而對(duì)乳酸乳球菌乳脂亞種MG1363的分析，發(fā)現(xiàn)該菌含有2對(duì)CSP基因 （cspA-cspB和cspC-cspD）、1個(gè)單個(gè)基因cspE以及一個(gè)cspD2，同時(shí)發(fā)現(xiàn)適量的CSPC可以促進(jìn)cspB、cspF和cspG基因的表達(dá)[3]。 MG1363中的7個(gè)CSP基因[3]與同種的IL1403中的2個(gè)基因截然不同。同樣,植物乳桿菌C3.8菌株中含有2個(gè)CSP基因（cspL和cspP）[12]，而植物乳桿菌NC8菌株中，除含有上述兩個(gè)基因外，還檢測(cè)出cspC基因[13]。近來在L.piscium CNCM I-4031菌株中也發(fā)現(xiàn)了7 ku的CSP蛋白，但是雙向電泳研究表明該蛋白并非為冷刺激所誘導(dǎo)[5]。因此，應(yīng)對(duì)某些特定菌株進(jìn)行特定冷誘導(dǎo)蛋白種類和特性的研究。

此外，冷誘導(dǎo)蛋白的數(shù)量、種類及誘導(dǎo)效率與菌株處理或存放的溫度和時(shí)間也密切相關(guān)。20°C下，嗜熱鏈球菌培養(yǎng)2 h和4 h分別合成14個(gè)和18個(gè)冷誘導(dǎo)蛋白,而在10°C下培養(yǎng)4 h只合成4個(gè)冷誘導(dǎo)蛋白[10]。經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、核酸雜交技術(shù)和2-DE分析表明，MG1363的7個(gè)CSP蛋白中有5個(gè) （CspA、CspB、CspC、CspD、CspE）可以被誘導(dǎo)，并且在10°C下的誘導(dǎo)效率最高，而在20°C和4°C下誘導(dǎo)效率最低[14]。與乳酸乳球菌相似，植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌都會(huì)有相應(yīng)的最適的誘導(dǎo)溫度。到目前為止，德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌ATCC11842中，僅有1個(gè)CSP基因（CspA）被鑒定出。Serror等在42°C下培養(yǎng)德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌時(shí)檢測(cè)出CspA的轉(zhuǎn)錄，并發(fā)現(xiàn)25°C下其表達(dá)達(dá)到最大值[15]。低效率的CSPs誘導(dǎo)會(huì)使乳酸菌的生長(zhǎng)阻滯。因此,即使是同一菌株,其培養(yǎng)溫度的改變也會(huì)令其冷誘導(dǎo)蛋白的種類和活性發(fā)生改變。在工業(yè)生產(chǎn)中，測(cè)定CSPs誘導(dǎo)的最適溫度對(duì)于優(yōu)化是十分重要的。

1.2 脂肪酸的變化

低溫對(duì)細(xì)胞最重要的影響之一，是使細(xì)胞膜固有的液態(tài)結(jié)晶轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動(dòng)性下降。在冷凍過程中，乳酸菌細(xì)胞膜中的脂肪酸會(huì)發(fā)生改變，不飽和脂肪酸含量增加，而飽和脂肪酸含量下降。由于不飽和脂肪酸的熔點(diǎn)較低，使得在低溫下仍能夠保持液態(tài)，從而在冷凍過程中細(xì)胞膜的流動(dòng)性得以增加。一些脫氫酶類在該變化中起著重要作用，如大腸桿菌中，β-酮?；；d體蛋白合成酶可以將棕櫚油酸轉(zhuǎn)化為異油酸[16]。研究表明，L.piscium CNCM I-4031菌株在冷刺激和冷馴化后，一些脂肪酸代謝相關(guān)的酶表達(dá)量發(fā)生明顯變化，其中包括β-酮?；d體蛋白（ACP）合成酶III（FabH），該酶參與II型脂肪酸合成的最初階段；β-酮脂酰ACP合成酶II（FabF）和β-酮脂酰ACP還原酶（FabG），二者參與脂肪酸伸長(zhǎng)率。在冷刺激后，F(xiàn)abH合成量上升，F(xiàn)abF表達(dá)量下降；FabG在冷馴化后，表達(dá)量下降[5]。Béal等研究表明，增加不飽和脂肪酸的含量，會(huì)使嗜熱鏈球菌具有較好的抗凍性[17]。此外，一些特異性脂肪酸對(duì)于乳酸菌的抗冷凍性也起著重要作用。Murga等對(duì)嗜酸乳桿菌進(jìn)行冷刺激試驗(yàn)，結(jié)果表明C18:2脂肪酸的含量明顯增加[18]。在低溫條件下,植物乳桿菌中C18:1脂肪酸含量同樣有所增加[19]。另外,德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌L2、嗜酸乳桿菌以及瑞士乳桿菌抗凍性能的提高與cycC19:0脂肪酸含量的增加密切相關(guān)[20,21]。

環(huán)丙烷脂肪酸（Cyclopropane Fatty Acid，CFA）是通過對(duì)已整合到磷脂分子的不飽和脂肪酸的后合成修飾形成，即從S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）轉(zhuǎn)移一個(gè)甲基基團(tuán)到不飽和脂肪酸的雙鍵上，形成環(huán)丙烷脂肪酸。研究證實(shí)，環(huán)丙烷脂肪酸有利于提高德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌和舊金山乳桿菌的抗凍能力[20,22]。Zhang等人對(duì)Oenococcus oeni的冷凍干燥研究中發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙烷脂肪酸C19cyc11的形成對(duì)保護(hù)細(xì)胞扮演了重要角色[23]。因此，檢測(cè)不同菌株的抗凍能力，可通過測(cè)定脂肪酸的含量及其組成成分來確定。

1.3 核糖體狀態(tài)的變化

細(xì)菌中核糖體對(duì)溫度具有敏感性[24]，其狀態(tài)會(huì)隨著溫度變化而發(fā)生改變。隨著溫度的升高，其翻譯的速度會(huì)大大升高，而帶有相應(yīng)氨基酸的tRNA的提供速度卻變化不大，使得核糖體的酰胺基位點(diǎn)空缺。此外，冷刺激使核糖體翻譯的效率變低，而在相應(yīng)酰胺基位點(diǎn)上，由于氨基酰tRNA濃度的增加受到阻礙，進(jìn)而降低了(p)ppGpp五磷酸鳥苷（鳥苷5’-三磷酸-3’二磷酸）的濃度。升高溫度有助于(p)ppGpp的集中，而降低溫度則會(huì)降低(p)ppGpp的濃度。研究表明，高濃度(p)ppGpp可以降低CSP的表達(dá)，而低濃度則會(huì)增加CSP的表達(dá)[25]。因此，機(jī)體對(duì)于冷刺激的反應(yīng)很大程度上受(p)ppGpp的影響。

1.4 核酸的變化

DNA通常為負(fù)超螺旋，且易受到溫度的影響。其延伸由DNA促旋酶和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ調(diào)控。研究表明，細(xì)菌在受到冷刺激之后，DNA負(fù)超螺旋迅速增加。DNA超螺旋的調(diào)節(jié)對(duì)DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組等功能具有重要作用。一些相關(guān)的變化（如堿基對(duì)數(shù)量的改變）也是由于超螺旋密度的改變而引起的[26]。Mizushima等將大腸桿菌置于6°C低溫水浴中培養(yǎng)，提取不同培養(yǎng)時(shí)間大腸桿菌的質(zhì)粒DNA，并用含磷酸氯喹的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，結(jié)果顯示,低溫使細(xì)胞中質(zhì)粒DNA負(fù)超螺旋增加，但是該反應(yīng)是短暫的，60 min內(nèi)DNA高度超螺旋狀態(tài)就會(huì)恢復(fù)[27]。

2 乳酸菌抗凍能力的測(cè)定

乳酸菌抗冷凍能力，即乳酸菌細(xì)胞冷凍儲(chǔ)藏于20°C之后恢復(fù)其酸化活力的能力。根據(jù)乳酸菌抗凍機(jī)理，對(duì)待選菌株的抗凍能力進(jìn)行篩選，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)有著重要的意義。

2.1 脂肪酸的測(cè)定

可以通過氣相色譜法對(duì)乳酸菌細(xì)胞膜脂肪酸的含量進(jìn)行快速測(cè)定[28]。Wang等對(duì)植物乳桿菌和酒明串珠菌進(jìn)行了研究，首先提取菌體脂肪酸并進(jìn)行甲基化，然后利用氣相色譜進(jìn)行分析，總結(jié)出酒明串珠菌中除主要成分C16:0外，還含有C14:0和C18:0等；而植物乳桿菌中細(xì)胞膜脂肪酸的主要成分為C18:1ω-7[29]。嗜酸乳桿菌RD758細(xì)胞膜中含有13種脂肪酸，氣相色譜分析發(fā)現(xiàn)，冷凍后，細(xì)菌細(xì)胞膜中的脂肪酸種類未發(fā)生變化，但是不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例發(fā)生了明顯變化。15°C下冷凍8 h后，細(xì)菌細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例以及cycC19:0相對(duì)百分比的變化影響最大[29]。Montanari等人優(yōu)化了氣相色譜方法，成功測(cè)定了Lactobacillus helveticus和L.sanfranciscensis中環(huán)丙烷脂肪酸的含量。二者受到冷刺激后，環(huán)丙烷脂肪酸的含量發(fā)生明顯變化[22]。

2.2 乳酸脫氫酶的測(cè)定

乳酸脫氫酶（LDH）是存在于細(xì)胞內(nèi)參與糖酵解最后一步的一種催化酶。當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，LDH會(huì)流到培養(yǎng)液中。因此，乳酸菌經(jīng)過冷凍處理后，可通過測(cè)定培養(yǎng)基中LDH的含量，從而得知乳酸菌細(xì)胞的受損情況，進(jìn)而反映出其抗冷凍能力。

通常采用比色法對(duì)乳酸脫氫酶進(jìn)行測(cè)定[30]。乳酸與氧化型輔酶Ⅰ（NAD）在LDH催化作用下生成丙酮酸與還原型輔酶Ⅰ（NADH）,丙酮酸再與2，4-二硝基苯肼進(jìn)行反應(yīng)生成2，4-二硝基苯腙，而 2，4-二硝基苯腙在堿性溶液中呈棕紅色。因此，可通過比色法測(cè)定丙酮酸含量，從而推算出LDH的活力。

2.3 酸化活力的測(cè)定

酸化活力即乳酸菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸的能力。乳酸菌酸化活力的測(cè)定可以采用pH計(jì)直接測(cè)定。首先待測(cè)菌株接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，放置于適當(dāng)溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。連續(xù)測(cè)定樣品菌懸液的pH值，直至pH值為5.5時(shí)停止，記錄培養(yǎng)時(shí)間。樣品菌懸液pH值下降至5.5所需時(shí)間越長(zhǎng)，則表示菌的酸化活力越弱。檢測(cè)冷凍前后酸化活力，通過冷凍后及冷凍前的時(shí)間差值，即可看出不同乳酸菌的抗冷凍能力。

3 結(jié)束語

低溫環(huán)境中的乳酸菌是一類非常有應(yīng)用價(jià)值的資源。目前國內(nèi)外對(duì)于低溫環(huán)境中乳酸菌的抗凍機(jī)制的研究并不深入。對(duì)于低溫環(huán)境中的乳酸菌的研究，過去主要集中應(yīng)用于傳統(tǒng)培養(yǎng)。最近幾年，許多研究者將分子生態(tài)學(xué)方法應(yīng)用于低溫乳酸菌的鑒定和分離，使得對(duì)這一領(lǐng)域的研究更加深入。隨著人們對(duì)低溫乳酸菌抗凍機(jī)制認(rèn)識(shí)的逐步深入，相信這類資源會(huì)有廣泛的應(yīng)用前景。

[1]STORZ G,HENGGE-ARONIS R.Bacterial Stress Responses[M].Washington:ASM Press,2000,33-45.

[2]DE ANGELIS M,GOBBETTI M.Environmental Stress Responses in Lactobacillus:A Review[J].Proteomics,2004,4:106-122.

[3]WOUTERS J A,MAILHES M,ROMBOUTS F M,et al.Physiological and Regulatory Effects of Controlled Overproduction of Five Cold Shock Proteins of Lactococcus lactis MG1363[J].Applied and Environmental Microbiology,2000,66(9):3756-3763.

[4]WOUTERS J A,KAMPHUIS H H,HUGENHOLTZ J,et al.Changes in Glycolytic Activity of Lactococcus lactis Induced by Low Temperature[J].Applied and Environmental Microbiology,2000,66,3686-3691.

[5]GARNIER M,MATAMOROS S,CHEVRET D,et al.Adaptation to Cold and Proteomic Responses of the Psychrotrophic Biopreservative Lactococcus piscium Strain CNCM I-4031[J].Applied and Environmental Microbiology,2010,76(24):801-8018.

[6]JIANG W,HOU Y,INOUYE M.CspA,the Major Cold-Shock Protein of Escherichia coli,is an RNA Chaperone[J].Journal of Biological Chemistry,1997,272(1):196-202.

[7]KIM WS,KHUNAJAKR N,REN J,et al.Conservation of the Major Cold Shock Protein in Lactic Acid Bacteria[J].Current Microbiology,1998,37(5):333-336.

[8]CAPOZZI V,FIOCCO D,SPANO G.Responses of Lactic Acid Bacteria to Cold Stress.TSAKALIDOU E,PAPADIMITRIOU K(eds.),Stress Responses of Lactic Acid Bacteria,Food Microbiology and Food Safety[J].New York:Springer,2011,91-110.

[9]PERRIN C,GUIMONT C,BRACQUART P,et al.Expression of a New Cold Shock Protein of 21.5 kDa and of the Major Cold Shock Protein by Streptococcus thermophilus After Cold Shock[J].Current Microbiology,1999,39,342-247.

[10]WOUTERS J A,ROMBOUTS B,DE VOS W M,et al.Cold Shock Proteins and Low-Temperature Response of Streptococcus thermophilus CNRZ302[J].Applied and Environmental Microbiology,1999,65,4436-4442.

[11]BOLOTIN A,WINCKER P,MAUGER S,et al.The Complete Genome Sequence of the Lactic Acid Bacterium Lactococcus lactis ssp.lactis IL1403[J].Genome Research,2001,11(5):731-753.

[12]MAYO B,DERZELLE S,FERNáNDEZ M,et al.Cloning and Characterization of csp L and csp P,Two Cold-inducible Genes from Lactobacillus plantarum[J].Journal of Bacteriology,1997,179(9):3039-3042.

[13]DERZELLE S,HALLET B,FRANCIS KP,et al.Changes in cspL,cspP,and cspC mRNA Abundance as a Function of Cold Shock and Growth Phase in Lactobacillus plantarum[J].Journal of Bacteriology,2000,182(18):5105-5113.

[14]WOUTERS J A,JEYNOV B,ROMBOUTS F M,et al.Analysis of the Role of 7 kD Cold-shock Proteins of Lactococcus lactis MG1363 in cryoprotection[J].Microbiology,1999,145(11):3185-3194.

[15]SERROR P,DERVYN R,EHRLICH SD,et al.Csp-like Genes of Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus and Their Response to Cold Shock[J].FEMS Microbiology Letters,2006,226(2):323-330.

[16]STORZ G,HENGGE-ARONIS R.Bacterial Stress Responses.Washington:ASM Press,2000:33-45.

[17]BéAL C,FONSECA F,CORRIEU G.Resistance to Freezing and Frozen Storage of Streptococcus thermophilus is Related to Membrane Fatty Acid Composition[J].Journal of Dairy Science,2001,84(11):2347-2356.

[18]MURGA MLF,CABRERA G M,DE VALDEZ G F,et al.Influence of Growth Temperature on Cryotolerance and Lipid Composition of Lactobacillus acidophilus[J].Journal of Applied Microbiology,2000,88(2):342-348.

[19]RUSSELL N J,EVANS R I,STEEG P F,et al.Membranes as a Target for Stress Adaptation[J].International Journal of Food Microbiology,1995,28(2):255-261.

[20]ZAVAGLIA AG,DISALVO AE,DE ANTONI LG.Fatty Acid Composition and Freeze-thaw Resistance in Lactobacilli[J].Journal of Dairy Research,2000,67(2):241-247.

[21]LI C,ZHAO J L,WANG Y T,et al.Synthesis of Cyclopropane Fatty Acid and its Effect on Freeze-drying Survival of Lactobacillus bulgaricus L2 at Different Growth Conditions[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2009,25:1659-1665.

[22]MONTANARI C,SADO KAMDEM S L,SERRAZANETTI D I,et al.Synthesis of Cyclopropane Fatty Acids in Lactobacillus helveticus and Lactobacillus sanfranciscensis and their Cellular Fatty Acids Changes Following Short Term Acid and Cold Stresses[J].Food Microbiology,2010,27:493-502.

[23]ZHANG G Q,FAN M T,LV Q,et al.The Effect of Cold,Acid and Ethanol Shocks on Synthesis of Membrane Fatty Acid,freezedrying survival and malolactic activity of Oenococcus oeni[J].Annals of Microbiology,2013,63:477-485.

[24]VANBOGELEN R A,NEIDHARDT F C.Ribosomes as Sensors of Heat and Cold Shock in Escherichia coli[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1990,87(15):5589-5593.

[25]JONES P G,CASHEL M,GLASER G,et al.Function of a Relaxed Like State Following Temperature Downshifts in Escherichia coli[J].Journal of Bacteriology,1992,174(12):3903-3914.

[26]KRISPIN O,ALLMANSBERGER R.Changes in DNA Supertwist as a Response of Bacillus subtilis Towards Different Kinds of Stress[J].FEMS Microbiology Letters,2006,134(2/3):129-135.

[27]MIZUSHIMA T,KATAOKA K,OGATA Y,et al.Increase in Negative Supercoiling of Plasmid DNA in Escherichia coli Exposed to Cold Shock[J].Molecular Microbiology,1997,23(2):381-386.

[28]ROZèS N,GATBAY S,DENAYROLLES M,et al.A Rapid Method for the Determination of Bacterial Fatty Acid Composition[J].Letters in Applied Microbiology,1993,17(3):126-131.

[29]WANG Y,DELETTRE J,GUILLOT A,et al.Influence of Cooling Temperature and Duration on Cold Adaptation of Lactobacillus acidophilus RD758[J].Cryobiology,2005,50(3):294-307.

[30]洪慶濤,宋岳濤,唐一鵬,等.細(xì)胞培養(yǎng)液乳酸脫氫酶漏出率的比色測(cè)定及其應(yīng)用[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志,2004,26(1):89.92.