穆小婷，董文賓，王玲玲，修秀紅

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，西安 710021；2.山東福田藥業(yè)有限公司，山東 禹城 251200)

0 引 言

乳及乳制品中所含各種營(yíng)養(yǎng)元素與人體營(yíng)養(yǎng)需求相似，易于消化吸收，是人們?nèi)粘２豢扇鄙俚臓I(yíng)養(yǎng)品之一，但是近年來(lái)乳品摻假現(xiàn)象屢禁不止，所以急需尋找一種新型、高效、準(zhǔn)確的乳品安全檢測(cè)分析技術(shù)。生物芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代初期發(fā)展起來(lái)的一種全新的微量分析技術(shù)，利用微電子、微機(jī)械、化學(xué)、物理以及計(jì)算機(jī)技術(shù)，將生命科學(xué)研究中的樣品檢測(cè)、分析過(guò)程實(shí)現(xiàn)連續(xù)化、集成化、微型化，其效率是傳統(tǒng)檢測(cè)手段的成百上千倍[1]。生物芯片包含的種類(lèi)較多，主要有基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片、微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等，其中基因芯片是生物芯片技術(shù)中發(fā)展最成熟以及最先進(jìn)入應(yīng)用和實(shí)現(xiàn)商品化的領(lǐng)域，芯片實(shí)驗(yàn)室是集樣品制備、基因擴(kuò)增、核酸標(biāo)記及檢測(cè)為一體，實(shí)現(xiàn)生化分析全過(guò)程，是生物芯片發(fā)展的最高階段[2-5]。

1 特異性生物芯片技術(shù)在乳品檢測(cè)中的應(yīng)用

目前生物芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域，乳及乳制品中成分含量非常復(fù)雜，所以有效地將生物芯片應(yīng)用于牛乳的檢測(cè)，將對(duì)未來(lái)乳品行業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生不可阻擋的動(dòng)力。文章針對(duì)目前國(guó)內(nèi)外利用特異性生物芯片檢測(cè)乳及乳制品的應(yīng)用情況進(jìn)行了全面綜述，包括在致病微生物、抗生素、毒素、藥物殘留、轉(zhuǎn)基因食品及其他方面的應(yīng)用。

1.1 特異性生物芯片技術(shù)在致病微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用

牛奶中微生物的含量是評(píng)價(jià)牛奶質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo),對(duì)最終產(chǎn)品質(zhì)量起著關(guān)鍵性的作用。傳統(tǒng)的致病微生物檢測(cè)方法主要有平板計(jì)數(shù)法和顯微鏡直接觀察法等，它們不僅周期長(zhǎng)、操作繁瑣，且靈敏度不高，使得食品的安全檢測(cè)存在一定的危險(xiǎn)，給消費(fèi)者帶來(lái)威脅，現(xiàn)代技術(shù)用的比較多的PCR法比前者快速、靈敏，但成本高，假陽(yáng)性多，也不是很好的檢測(cè)食品微生物污染的方法。而生物芯片技術(shù)由于其具有高通量、高靈敏度和高特異性等優(yōu)點(diǎn)，可以及時(shí)反映食品中微生物的污染情況，獲得了人們的廣泛青睞，它可應(yīng)用于各種導(dǎo)致食品腐敗的致病菌的檢測(cè),能及時(shí)、快速、準(zhǔn)確地反映乳品中微生物的污染情況。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者開(kāi)始用生物芯片技術(shù)對(duì)食品中常見(jiàn)致病菌進(jìn)行檢測(cè)，Cremonesi等[6]根據(jù)連接酶檢測(cè)反應(yīng)設(shè)計(jì)了一種新的DNA芯片，直接從乳樣品中鑒定能引起牛羊的乳房炎或引起食品中毒的15種細(xì)菌：金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌等，并對(duì)50個(gè)乳樣品迸行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示出高特異性，靈敏度達(dá)到6 fmol。

YANG L[7]試驗(yàn)了將雙向電泳和固定化生物芯片結(jié)合使用來(lái)檢測(cè)食源性致病菌，最終證明，這倆種方法的結(jié)合可大大提高生物芯片的免疫捕捉能力和檢測(cè)效率。

我國(guó)國(guó)家生物芯片中心等單位已開(kāi)發(fā)并生產(chǎn)食源性致病菌檢測(cè)、食源性病毒檢測(cè)的生物芯片技術(shù)平臺(tái)儀器和試劑盒[8]。相信不久的將來(lái)，芯片技術(shù)將越來(lái)越多地進(jìn)入乳品類(lèi)食品病原菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)的集成化、一體化。

奶牛乳房炎是奶牛三大疾病之一，會(huì)嚴(yán)重降低奶牛產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)量，而病原微生物感染是奶牛乳房炎常見(jiàn)的病因，據(jù)大量文獻(xiàn)報(bào)道，金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌為引起奶牛乳房炎的主要病原菌。韓旭等[9]全面綜述了PCR、基因芯片和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在奶牛乳房炎主要病原菌診斷中的應(yīng)用。邢會(huì)杰等[10]建立了奶牛乳房炎無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌5種主要致病菌的基因芯片檢測(cè)方法，結(jié)果顯示芯片檢測(cè)特異性高、檢測(cè)的靈敏度為103CFU/mL。

1.2 特異性生物芯片技術(shù)在抗生素檢測(cè)方面的應(yīng)用

抗生素殘留不僅影響乳及乳制品的品質(zhì)，而且還會(huì)降低產(chǎn)量及破壞后期產(chǎn)品風(fēng)味，給生產(chǎn)者造成經(jīng)濟(jì)損失，且會(huì)對(duì)人體造成極大的傷害。自2006年7月起國(guó)家規(guī)定對(duì)所有生鮮牛奶強(qiáng)制檢測(cè)抗生素含量，超標(biāo)者不可出售[11]。目前對(duì)抗生素的檢測(cè)方法主要有理化檢測(cè)法，微生物檢測(cè)法和免疫檢測(cè)法等，儀器檢測(cè)法雖然靈敏，但檢測(cè)費(fèi)用高，很難普及使用，傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法費(fèi)用低，一般實(shí)驗(yàn)室都能操作，但時(shí)間長(zhǎng)、易產(chǎn)生誤差、操作復(fù)雜。

Knecht等[12]利用硅烷化修飾的片基制備抗原點(diǎn)陣，自動(dòng)化分析牛奶中10種抗生素含量，包括β-內(nèi)酰胺類(lèi)、磺胺類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程自動(dòng)化，單個(gè)組分檢測(cè)所用時(shí)間不到5 min，10種組分的檢測(cè)線在0.12～32 ug之間。

Kloth等[13]建立的間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光免疫芯片法，可在幾分鐘內(nèi)同時(shí)檢測(cè)牛奶中13種抗生素的含量。他們對(duì)片基采取了多步化學(xué)處理后，最終在玻片表面修飾上環(huán)氧樹(shù)脂活化的PEG層，然后加入磺胺類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)等的衍生物，直接與環(huán)氧樹(shù)脂進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，無(wú)需再加其他偶聯(lián)劑。該方法靈敏度較高，且可重復(fù)使用50次，增加了測(cè)定的穩(wěn)定性和便捷性，且減少重新制備片基。

Bang-Ce Y等[14]報(bào)道了利用間接競(jìng)爭(zhēng)熒光免疫蛋白芯片法同時(shí)測(cè)定牛奶中磺胺二甲嘧啶、鏈霉素，泰樂(lè)菌素的含量。結(jié)果顯示3種抗生素的檢測(cè)限分別為：3.26 ng/mL（磺胺二甲氧嘧啶），2.01 ng/mL（鏈霉素），637 ng/mL（泰樂(lè)菌素），均低于各自的最大殘留量。并對(duì)實(shí)際樣品牛奶進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果取得了較好的加樣回收率。

左鵬,葉邦策等[15]利用蛋白芯片法快速測(cè)定乳品中氯霉素和磺胺二甲嘧啶殘留，并且同現(xiàn)行的免疫學(xué)測(cè)定方法進(jìn)行了比較，結(jié)果證明利用蛋白芯片競(jìng)爭(zhēng)法可以快速準(zhǔn)確測(cè)定動(dòng)物源性食品中氯霉素磺胺二甲嘧啶的殘留。

1.3 特異性生物芯片在毒素檢測(cè)方面的應(yīng)用

毒素對(duì)人體的健康影響甚大，曾被世界衛(wèi)生組織列為食源性疾病的重要根源。目前常用的乳及乳制品中毒素的檢測(cè)方法主要是化學(xué)分析方法、儀器法、免疫學(xué)方法或這些方法的相互結(jié)合等[16]。生物傳感技術(shù)作為一種全新的微量分析技術(shù),將生物技術(shù)和電子技術(shù)相結(jié)合,從而能夠進(jìn)行生命物質(zhì)和化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)和監(jiān)控的裝置。

早在1996年，高志賢等[17]便采用壓免疫傳感器檢測(cè)牛奶中C型葡萄球菌腸毒素,并用多種方法比較電極再生,所制作的壓電免疫傳感器簡(jiǎn)單、靈敏,檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到2.5 μg/L。

Strachan等[18]采用自動(dòng)免疫傳感器檢測(cè)乳酪中的腸毒素等物質(zhì)，結(jié)果證明試驗(yàn)只需要10 min便可出現(xiàn)結(jié)果,檢測(cè)最低限為5 ng/g。

Medina等[19]應(yīng)用表面質(zhì)粒共振生物傳感器(SPR)檢測(cè)牛奶樣品中的腸毒素B,靈敏度可達(dá)到0.5 ng/mL。SPR檢測(cè)的缺陷是只能同時(shí)分析幾種物質(zhì)(少于4種)，不能區(qū)分特異的靶物質(zhì)和芯片表面其他樣本的非特異交叉反應(yīng)物，對(duì)于固定的受體,當(dāng)其發(fā)生點(diǎn)突變、化學(xué)改變或功能活性改變時(shí),SPR不能將其同完整的分析物加以區(qū)分。

1.4 特異性生物芯片技術(shù)在藥物殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用

乳品中的藥物殘進(jìn)入人體對(duì)人類(lèi)的健康構(gòu)成潛在的威脅，目前多種藥物殘留可以通過(guò)生物芯片技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，主要包括磺胺二甲基嘧啶、鏈霉素、恩諾沙星和克倫特羅[20]，具有前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好、檢測(cè)速度快、檢測(cè)通量高、質(zhì)控體系嚴(yán)密等優(yōu)點(diǎn)。

郭志紅等[21]應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)建立了動(dòng)物組織中重要獸藥(磺胺二甲基嘧啶、恩諾沙星、鹽酸克倫特羅和鏈霉素)的高通量篩選方法，并與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜和微生物檢定法進(jìn)行了比對(duì)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，用蛋白芯片進(jìn)行獸藥殘留檢測(cè)的樣品前處理方法簡(jiǎn)單、速度快，且用同一種方法提取了多種獸藥，節(jié)省了提取溶劑的用量，在環(huán)保方面也有很大的優(yōu)勢(shì)。

陳愛(ài)亮等[22]根據(jù)抗原和抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)原理，采用熒光標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)免疫法，構(gòu)建蛋白芯片測(cè)定樣品中的獸藥殘留含量。同時(shí)結(jié)合博奧生物有限公司研發(fā)的樣品分子提取儀、芯片掃描儀以及配套的自動(dòng)化數(shù)據(jù)分析軟件，開(kāi)發(fā)了晶芯獸藥殘留蛋白芯片檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可用于豬肉、雞肉、牛奶中磺胺類(lèi)物質(zhì)、鏈霉素、雙氫鏈霉素、恩諾沙星以及氯霉素的定量檢測(cè)。

吳長(zhǎng)紅[23]在“2011年第四屆國(guó)際食品安全高峰論談?wù)撐募敝幸舶l(fā)表了有關(guān)生物芯片陣列技術(shù)在檢測(cè)食品中多種殘留物的文章，包括乳品中磺胺二甲基嘧啶的檢測(cè)。

1.5 特異性生物芯片技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品方面的應(yīng)用

自1994年美國(guó)第一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品——轉(zhuǎn)基因番茄獲得FDA的批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)以來(lái) ,轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物在全球內(nèi)飛速發(fā)展。在乳業(yè)中，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以從微觀的分子水平上認(rèn)識(shí)物質(zhì)，進(jìn)行分子操作來(lái)生產(chǎn)乳品，這一方面加快了現(xiàn)代乳品加工技術(shù)創(chuàng)造性的融合和發(fā)展，但由于在新產(chǎn)品中導(dǎo)入了外源基因或改變了原有的基因表達(dá)方式，這就涉及到轉(zhuǎn)基因食品的安全性問(wèn)題，而基因芯片可以檢測(cè)出食品中是否含有轉(zhuǎn)基因,以及含有何種轉(zhuǎn)基因。目前市場(chǎng)上常用的轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)方法主要包括PCR檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫吸附法 、電泳法、波長(zhǎng)色散x射線熒光法、各種雜交法和生物測(cè)定檢測(cè)法等，但這些方法大多只能對(duì)單個(gè)檢測(cè)目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，且假陽(yáng)性高，時(shí)間周期長(zhǎng)，而基因芯片技術(shù)則可以彌補(bǔ)這幾方面的不足[24]。

Deisingh等[25]綜述了食品中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的不同檢測(cè)方法，包括PCR法，生物傳感芯片法、商品化試劑盒、電泳法、波長(zhǎng)色散x射線熒光法等，芯片法以其高通量、微型化、自動(dòng)化的特點(diǎn)而占據(jù)著顯著的優(yōu)勢(shì)。乳蛋白量和乳脂量作為奶牛生產(chǎn)重要的經(jīng)濟(jì)性狀,可直接影響牛奶的營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味和牛奶產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張磊[26]選取金華伊康乳業(yè)奶牛場(chǎng)內(nèi)處于干奶期、泌乳前期、泌乳中期以及泌乳后期的中國(guó)荷斯坦牛各15頭作為研究對(duì)象,分析不同泌乳時(shí)期的?；蚪M表達(dá)譜的變化情況，選取與奶牛泌乳過(guò)程中密切相關(guān)的JAK-STAT信號(hào)通路作為研究對(duì)象,確定不同泌乳時(shí)期該通路內(nèi)基因表達(dá)的變化情況,并根據(jù)各基因的生物學(xué)功能初步確定與泌乳性狀相關(guān)的候選基因，從而為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)乳品奠定了基礎(chǔ)。

1.6 特異性生物芯片技術(shù)在其他方面的應(yīng)用

生物芯片由于其特有的優(yōu)勢(shì)，已逐漸應(yīng)用于乳品檢測(cè)的各個(gè)方面。大家知道牛奶受細(xì)菌作用會(huì)產(chǎn)生乳酸,而測(cè)定牛奶新鮮度的乳酸傳感器已成為中國(guó)微生物傳感器應(yīng)用的基本品種。另外也可從牛奶放置過(guò)程中脂解作用產(chǎn)生的短鏈脂肪酸的含量來(lái)判斷牛奶及其制品的新鮮度,這類(lèi)傳感器也己開(kāi)發(fā)出來(lái)[27]。另外生物芯片也已應(yīng)用于食品毒理學(xué)評(píng)價(jià)及營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)等，如2008年M.Lefevre等[28]以富含花青素的葡萄為模型，利用基因芯片研究了食品成分與健康食品的作用機(jī)理，并提出了3種新的可以檢驗(yàn)的關(guān)于食品成分和健康食品的作用機(jī)理的假說(shuō)。雖然到現(xiàn)在為止很多研究沒(méi)有直接針對(duì)乳及其制品，但是相信隨著生物技術(shù)的不斷成熟，生物芯片技術(shù)必將成為乳及乳制品檢測(cè)的重要方法之一。

2 展 望

特異性生物芯片技術(shù)作為一種新型的生物技術(shù)，是一個(gè)學(xué)科交叉性很強(qiáng)的研究領(lǐng)域，其巨大的潛力和誘人的商業(yè)前景是有目共睹的，但由于目前的一些技術(shù)難點(diǎn)還沒(méi)有完全攻破，如由于污染等原因而影響檢測(cè)的靈敏度、提高生物芯片微陣列的密度、簡(jiǎn)化樣品制備和標(biāo)記操作等,從而極大限制了市場(chǎng)需求。相信隨著各國(guó)研究者的不斷努力,隨著這些技術(shù)的進(jìn)一步完善,基因芯片技術(shù)必將成為21世紀(jì)最具活力的技術(shù)之一，必將受到世界各個(gè)國(guó)家及其學(xué)術(shù)界的關(guān)注，必將在乳品生產(chǎn)的全程質(zhì)量控制、構(gòu)建有效的乳品安全體系等方面發(fā)揮更大的作用。

[1]孔金明.生物芯片技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用綜述[J].鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013,01:1-6+15.

[2]ZHANG W.Application of biochip technology[J].Journal of Biotechnology,2008,136:591.

[3]ZHANG H,YANG X,ZHANG Y,et al.Application of Gene Chip in Pathogenic Microorganism Detection and Research [J].Progress in Veterinary Medicine,2009,12:28.

[4]BODOVITZ S,JOOS T,BACHMANN J.Protein Biochips:the Calm Before the Storm[J].Drug Discovery Today,2005,10(4):283-287.

[5]HENG Z,SNYDER M.Protein Chip Technology[J].Current Opinion in Chemical Biology,2003,7(1):55-63.

[6]CREMONESI P,PISONI G,SEVERGNINI M,et al.Pathogen Detection in Milk Samples by Ligation Detection Reaction-mediated U-niversal Array Method[J].Joumal of Dairy science,2009,92 (7):3027-3039.

[7]YANG L.Dielectrophoresis Assisted Immuno-capture and Detection of Foodborne Pathogenic Bacteria in Biochips[J].Talanta,2009,80(2):551-558.

[8]張守文,尹蕾,周玉玲，等.乳品中有害微生物的檢測(cè)技術(shù)和發(fā)展方向[J].中國(guó)乳品工業(yè),2010,38(1):35-38.

[9]韓旭,武瑞,孫東波.奶牛乳房炎主要病原菌基因檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2012,03:230-232.

[10]邢會(huì)杰,師志海,賈坤，等.基因芯片法檢測(cè)奶牛乳房炎主要致病菌[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2009,45(4):20-22..

[11]孟靜,王銳,祝建華，等.生鮮牛乳中抗生素檢測(cè)方法的新問(wèn)題[J].中國(guó)乳品工業(yè),2010,38(9):42-44.

[12]KNECHT B G,，STRASSER A，DIETRICH R,et al.Automated Microarray System for the Simultaneous Dtection of Antibiotics in Milk[J].Analytical Chemistry,2004,76(3):646-654.

[13]KLOTH K,RYE-JOHNSEN M,DIDIER A,et al.A Regenerable Immunochip for the Rapid Determination of 13 Different Antibiotics in Raw Milk[J].Analyst,2009,134(7):1433-1439.

[14]BANG-CE Y,SONGYANG L,PENG Z,et al.Simultaneous detection of sulfamethazine,streptomycin and tylosin in milk by microplate-array based SMM-FIA.Food Chemistry,2008,106(2):797-803.

[15]左鵬,葉邦策.蛋白芯片法快速測(cè)定食品中氯霉素和磺胺二甲嘧啶殘留[J].食品科學(xué),2007,28(2):254-258.

[16]鄭楠,王加啟,韓榮偉,等.牛奶中霉菌毒素檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2012,39(3):14-18.

[17]壓電免疫傳感器檢測(cè)牛奶中C型葡萄球菌腸毒素的初探 [J].中國(guó)食品衛(wèi)生,1996,8(6):17.

[18]STRACHAN N J,JOHN P G,，MILLAR I G,Application of a Rapid Automated Immunosensor for the Detection of Staphylococcus Aureus Enterotoxin B in Cream[J].J.Food Microbiol,1997,35(3):293-297.

[19]MEDINA,MARJORIE.A Biosensor Method for Detection of Staphylococcal Enterotoxin a(Sea)in Raw Whole Egg[J].Biotechnology Letters,2006,14:119-132.

[20]唐亞麗,盧立新,趙偉等.生物芯片技術(shù)及其在食品營(yíng)養(yǎng)與安全檢測(cè)中的應(yīng)用[J].食品與機(jī)械,2010,26(5):164-168.

[21]郭志紅,張榮,張連彥，等.蛋白芯片在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)獸藥雜志,2005,39(10):9-12.

[22]陳愛(ài)亮,王國(guó)青,王艷，等.獸殘留蛋白芯片檢測(cè)系統(tǒng)的研制和應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)療器械信息,2008,14(8):33-36.

[23]吳長(zhǎng)紅.生物芯片陣列技術(shù)同時(shí)快速檢測(cè)食品中多種殘留物 (英文)[J].第四屆中國(guó)北京國(guó)際食品安全高峰論壇論文集,2011.

[24]DEISINGHA A K,BADRIE N.Detection Approaches for Genetically Modified Organisms in Foods[J].Food Research International,2005,38(6):639-649.

[25]張磊.利用基因芯片技術(shù)篩選奶牛乳質(zhì)性狀相關(guān)基因[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[26]李菲,董文賓,高潔，等.生物傳惑器在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].江西食品工業(yè),2009(1):50-51,49.

[27]LEFEVRE M,WILES J E,ZHANG X,et al.Gene Expression Microarray Analysis of the Effects of Grape Anthocyanins in Mice:a Test of a Hypothesis-generating Paradigm[J].Metabolism,2008,57:S52-S57.