王英，周劍忠，黃開紅，李清，劉小莉，趙延存

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，南京210014）

0 引 言

乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharides,EPS）是乳酸菌生長代謝過程中分泌到細胞壁外的粘液多糖和莢膜多糖的總稱[1-2]。乳酸菌是天然的食品工業(yè)中生產(chǎn)菌種，其產(chǎn)生的EPS具有對機體無毒副作用，來源安全可靠等優(yōu)點，具有較高的安全性，近年來對乳酸菌的EPS的研究和開發(fā)引起廣大研究者和食品加工業(yè)的重視[3-5],乳酸菌胞外多糖是天然的生物增稠劑，它可以替代其他目前在應(yīng)用的、來源于非食品級微生物的穩(wěn)定劑或增稠劑[6]。乳酸菌胞外多糖能提高酸乳的品質(zhì)，能有效地保持凝膠結(jié)構(gòu)，防止乳清析出[7-8]，另外，EPS具有增強免疫力，抗腫瘤，抗病毒等功效[9-10]，隨著民眾保健意識的增強，對具有保健功效的功能食品及保健品愈發(fā)收到重視。

FM10-3分離自新疆地區(qū)傳統(tǒng)酸馬奶中，鑒定為干酪乳桿菌[11]。前期對FM10-3的生物學(xué)及發(fā)酵特性進行了系統(tǒng)的研究[12]，本文對其產(chǎn)EPS的發(fā)酵條件進行研究，為將其開發(fā)成功能性乳制品的菌種資源提供又一重要依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)FM10-3，本實驗室篩選保藏；MRS培養(yǎng)基按文獻[13]中的方法配制，121℃滅菌20 min。10%的脫脂牛奶，巴氏滅菌。

葡萄糖，檸檬酸氫二銨，K2HPO4，Tween-80，Mg-SO4·7H2O，乙酸鈉，苯酚，濃H2SO4，三氯乙酸，無水乙醇等，均為分析純試劑；酵母提取物、牛肉浸出粉 、酪蛋白胨為生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱，生化培養(yǎng)箱，UV-1600PC型分光光度計，超凈工作臺，電熱手提式高壓殺菌鍋，電子天平等。

1.3 方法

1.3.1 干酪乳桿菌的活化與擴大培養(yǎng)

將菌種的凍干粉分別接種到10%的滅菌脫脂牛奶管和液體MRS試管中，與37℃培養(yǎng)24 h，傳代2次。按3%的接種量分別接種到裝有10%的無菌的脫脂牛奶三角瓶和裝有液體MRS的三角瓶中，培養(yǎng)24 h，置冰箱中備用。

1.3.2 胞外多糖的分離提取

胞外多糖的提取參照文獻[14]和[15]并作適當(dāng)改進。取10 mL發(fā)酵液液于離心管中，冷凍離心去除菌體。上清液分別用蛋白酶等處理以脫除蛋白，再添加3倍體積的冷乙醇于上清液中，4℃下靜置過夜。冷凍離心得沉淀物，用冷乙醇洗滌沉淀物數(shù)次，再于90℃下干燥得胞外多糖粗提物。

1.3.3 胞外多糖的定量分析

采用苯酚一硫酸法[16]以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，490 nm檢測波長。同樣的操作，取1 mL的樣品液，測定490 nm吸收值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。

1.3.4 產(chǎn)糖條件

具體方法參照文獻[17]中方法，稍作修改。

（1）發(fā)酵溫度對胞外多糖產(chǎn)量的影響 培養(yǎng)基起始pH值為6.8、接種量為5%、發(fā)酵時間為28 h的前提條件下，研究不同發(fā)酵溫度(25，28，31，34，37，40 ℃)對合成胞外多糖產(chǎn)量的影響。

（2）發(fā)酵時間對胞外糖產(chǎn)量的影響 在產(chǎn)糖培養(yǎng)基起始pH為6.8、接種量為5%、發(fā)酵溫度為37℃的前提條件下，研究不同發(fā)酵時間(12，16，20，24，28，32，36，40 h)對胞外多糖產(chǎn)量的影響。

（3）培養(yǎng)基起始pH對胞外多糖產(chǎn)量的影響 在接種量為5%、發(fā)酵溫度為37℃、發(fā)酵時間為28 h的前提條件下，研究產(chǎn)糖培養(yǎng)基的不同起始pH值(5.5，6.0，6.5，7.0，7.5)對合成胞外多糖產(chǎn)量的影響。

（4）接種量對胞外多產(chǎn)量的影響 在產(chǎn)糖培養(yǎng)基起始pH為6.8、發(fā)酵溫度為37℃、發(fā)酵時間為28 h的前提條件下，研究不同接種量（2%，3%，4%，5%，6%，7%)對胞外多糖產(chǎn)量的影響。

（5）胞外多糖發(fā)酵條件的優(yōu)化。在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用中心組合實驗 Box-Behnken設(shè)計方案，以培養(yǎng)溫度、接種量以及培養(yǎng)時間，分別用Xl，X2，X3來表示；并以+1，0，-1別代表變量的水平，按方程xi=(Xi—Xo)／△X 自變量進行編碼。 式中，xi變量的編碼值，Xi為變量的真實值，X0驗中心點變量的真實值，△X為變量的變化步長，EPS質(zhì)量濃度Y為響應(yīng)值(表1)。

表1 中心組合試驗Box-Behnken方案設(shè)計的因素和水平編碼值

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對FM10-3 EPS產(chǎn)量的影響

微生物EPS的生成受培養(yǎng)溫度的影響很大，培養(yǎng)溫度的選擇是提高EPS產(chǎn)量的一個重要條件。溫度是影響細胞生長繁殖和EPS產(chǎn)量的重要因素之一，溫度不同，菌株的生長及其EPS產(chǎn)量亦明顯不同。培養(yǎng)溫度過低，菌體生長緩慢，菌體濃度不高，從而影響次生代謝產(chǎn)物EPS的產(chǎn)量；培養(yǎng)溫度過高，菌體培養(yǎng)后期易衰老進而自溶，菌體濃度亦不高，也會影響EPS的合成。FM10-3的EPS產(chǎn)量受培養(yǎng)溫度的影響結(jié)果如圖1所示，由圖1可以看出，不同發(fā)酵溫度條件下菌株FM10-3合成EPS的量不同，發(fā)酵溫度在34℃時EPS產(chǎn)量處于最大值，低于34℃時隨著溫度的升高，EPS產(chǎn)量呈線性增加，但溫度高于34℃時EPS產(chǎn)量開始下降，因此，菌株FM10-3合成胞外多糖的適宜溫度是34℃。

圖1 不同發(fā)酵溫度對胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.2 發(fā)酵時間對合成胞外多糖產(chǎn)量的影響

圖2為發(fā)酵時間對FM10-3的EPS產(chǎn)量的影響結(jié)果。由圖1可以看出，發(fā)酵時間長短對胞外多糖的產(chǎn)量影響較大。在不同的發(fā)酵時間菌株FM10-3合成EPS的量不同。發(fā)酵時間在28 h時EPS產(chǎn)量處于最大值。在發(fā)酵前期，EPS產(chǎn)量較低，這種現(xiàn)象說明在對數(shù)生長期由于培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)較充足，而有利于菌體生長繁殖，卻不利于胞外多糖的積累。發(fā)酵后期，菌體會分泌多糖降解酶而降低胞外多糖的產(chǎn)量。菌株FM10-3合成胞外多糖的適宜發(fā)酵時間28 h。

圖2 不同發(fā)酵時間對胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.3 pH值對合成胞外多糖產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基pH值高低對菌體生長繁殖與次生代謝產(chǎn)物胞外多糖的合成影響也很大，因為發(fā)酵液pH值的變化會影響發(fā)酵過程中多種酶的活性，當(dāng)pH值抑制菌體中某些酶的活性時，會阻礙菌體的新陳代謝。pH值不同，引起菌體代謝過程不同，使代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和比例發(fā)生改變。許多研究證實，在接近中性偏酸的pH值條件下，EPS生物合成量較大[18]。由圖3可以看出，在培養(yǎng)基不同起始pH值條件下菌株FM10-3合成EPS的量不同。培養(yǎng)基的起始pH值為6.5，即弱酸性條件時，使發(fā)酵液中胞外多糖產(chǎn)量達到最大值；培養(yǎng)基的pH值越接近中性偏堿條件，EPS產(chǎn)量越低，當(dāng)pH值在超過7.5時胞外多糖產(chǎn)量較低；當(dāng)培養(yǎng)基的pH值過低時，一方面分泌的多糖酶類有降解胞外多糖的作用[19]，另一方面pH值的降低會因失去脂質(zhì)載體中間體而使胞外多糖的合成受阻[20]。綜上所述，合成EPS的培養(yǎng)基適宜pH值為6.5。

圖3 培養(yǎng)基初始pH值對胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.4 接種量對合成胞外多糖產(chǎn)量的影響

圖4為接種量對胞外多糖產(chǎn)量的影響。由圖4可以看出，在試驗設(shè)計的發(fā)酵時間內(nèi)，不同的接種量菌株FM10-3合成EPS的量不同。接種量在5%時EPS產(chǎn)量處于最大值；接種量小于4%時EPS的產(chǎn)量處于較低水平；當(dāng)接種量超過6%時EPS產(chǎn)量急劇下降。這是由于接種量過高，發(fā)酵前期會使菌體生長過快、菌體濃度過高，中后期會因營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡而導(dǎo)致合成胞外多糖的前體物質(zhì)的減少，從而降低EPS的產(chǎn)量。綜上所述，菌株FM10-3合成EPS的適宜接種量是5%。

圖4 接種量的影響

2.5 響應(yīng)曲面實驗結(jié)果及分析

按表1列出的實驗組合進行FM10-3培養(yǎng)后提取EPS，獲得各種條件下EPS產(chǎn)量的提取值及其預(yù)測值，利用Design Expert軟件，對響應(yīng)值EPS產(chǎn)量的實驗值進行二次多項回歸擬合，建立EPS產(chǎn)量的回歸模型,回歸模型方程為

REPS產(chǎn)量=312.50+13.33X1+4.29X2+1.87X3+4.35X1X2+3.58X1X3-0.58X2X3-43.23X12-21.16X22-9.41X32。

對此模型進行方差分析結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，模型在α=0.01水平上回歸極顯著（P＜0.001），模型的確定系數(shù)R2=0.9993,校正后的決定系數(shù)（R2）達到 0.9983，表明二次模型能很好地擬合不同培養(yǎng)條件下EPS產(chǎn)量的變化，失擬項不顯著（P＞0.05），從另一角度說明該方程對數(shù)據(jù)進行了很好的擬合。

表2 Box-Behnken設(shè)計方案及實驗結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

表4為回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果。由表4可以看出，模型一次項X1和X2極顯著，X3顯著；二次項X12，X22，X32均處于極顯著水平；交互項X1X2極顯著，X1X3處于顯著水平、X2X3不顯著。

利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線如圖5～圖7所示。

圖6 pH值和溫度對EPS產(chǎn)量影響的響應(yīng)曲面和等高線

當(dāng)pH值為6.5時，培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度對EPS產(chǎn)量的影響如圖5所示。由圖5可以看出，當(dāng)培養(yǎng)時間不變，EPS產(chǎn)量會隨著溫度的增加而增加，當(dāng)溫度達到一定值后，EPS產(chǎn)量值呈現(xiàn)下降的趨勢。當(dāng)培養(yǎng)時間在25～28 h范圍內(nèi)，培養(yǎng)溫度在31～34℃范圍內(nèi)，EPS產(chǎn)量值隨著培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度的增加而增加，并最終達到最大值。

當(dāng)培養(yǎng)時間為28 h時，pH值和培養(yǎng)溫度對EPS產(chǎn)量的影響如圖6所示。由圖6可以看出，當(dāng)pH值不變時，隨著培養(yǎng)溫度的增加，EPS產(chǎn)量呈現(xiàn)增加的趨勢，當(dāng)溫度增加到一定值后，EPS產(chǎn)量值呈現(xiàn)下降的趨勢。當(dāng)pH值在6.2～6.5范圍內(nèi)，同時培養(yǎng)溫度在31～34℃范圍內(nèi)，EPS產(chǎn)量值隨著pH值和培養(yǎng)溫度的增加而增加，并最終達到最大值。

圖7 pH值和培養(yǎng)時間對EPS產(chǎn)量影響的響應(yīng)曲面和等高線

當(dāng)培養(yǎng)溫度為34℃時，培養(yǎng)時間和pH值對EPS產(chǎn)量的影響如圖7所示。由圖7可以看出，當(dāng)pH值不變時，隨著培養(yǎng)時間的延長，EPS產(chǎn)量增加，當(dāng)時間延長到一定值后，EPS產(chǎn)量值呈現(xiàn)下降的趨勢。當(dāng)培養(yǎng)時間在25～28 h范圍內(nèi)，pH值在6.2～6.5范圍內(nèi)，EPS產(chǎn)量值隨著pH值和培養(yǎng)時間的增加而增加，并最終達到極大值。

2.6 優(yōu)化組合及驗證實驗

當(dāng)培養(yǎng)時間、溫度和pH值范圍分別設(shè)定在25～31 h，31～37℃和 6.2～6.8時，并將胞外多糖產(chǎn)量設(shè)定為最大值時，軟件給出最優(yōu)組合，即最后優(yōu)化的產(chǎn)胞外多糖的最優(yōu)條件為：培養(yǎng)溫度為34.49℃，培養(yǎng)時間為28.35 h，pH值為6.54，此條件下EPS產(chǎn)量為313.973 mg/L。按實際可行設(shè)定情況，可設(shè)定培養(yǎng)溫度為34.5℃，培養(yǎng)時間為28.4 h，pH值為6.5，作為產(chǎn)EPS的最佳培養(yǎng)條件。為了進一步驗證產(chǎn)EPS的最優(yōu)的培養(yǎng)條件，采用上述條件進行了3次重復(fù)試驗，結(jié)果EPS產(chǎn)量在 （313.36±1.35）mg/L，與理論值 313.97 mg/L基本一致。

3 結(jié) 論

通過單因素試驗分析干酪乳桿菌FM10-3產(chǎn)EPS的主要影響因素，采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計及響應(yīng)面分析，建立干酪乳桿菌FM10-3產(chǎn)EPS二次多項式數(shù)學(xué)模型。獲得到干酪乳桿菌FM10-3產(chǎn)EPS最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為34.5℃，培養(yǎng)時間為28.4 h，pH值為6.5，在此條件下FM10-3的胞外多糖產(chǎn)量為313.36mg/L。經(jīng)檢驗證明該模型是合理可靠的，能夠較好地預(yù)測干酪乳桿菌FM10-3產(chǎn)EPS的量。

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