劉芳，黃丹，陳永貴，樊江

（四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000）

0 引 言

乳酸菌胞外多糖（EPS）是乳酸菌在其生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外常滲于培養(yǎng)基的一類糖類化合物，因其重要的理論和實踐意義，在醫(yī)療、食品、化妝品和酶技術(shù)等方面具有潛在的開發(fā)價值?，F(xiàn)有研究表明，可生物合成胞外多糖的乳酸菌主要有：德氏乳桿菌保加利亞亞種、瑞士乳桿菌、米酒乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、唾液鏈球菌嗜熱亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、腸膜明串珠菌等[1]。但不同乳酸菌胞外多糖的合成能力差別很大，不同的營養(yǎng)基質(zhì)和發(fā)酵條件其生物合成量也很不相同。本研究對保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖的影響因素進(jìn)行研究，旨在為高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

牛肉膏，蛋白胨，胰蛋白胨，酪蛋白胨，植物蛋白胨，酵母膏，D-半乳糖，麥芽糖，乳糖為生化試劑；葡萄糖、吐溫80、乙酸鈉、硫酸銨、硫酸錳、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯甲烷、正丁醇、乙醇（體積分?jǐn)?shù)95%）、丙酮、苯酚、濃硫酸、蔗糖等為分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

校CP114電子天平，YX-18HM手提式壓力蒸汽滅菌器，BH200生物顯微鏡，GZ-250-HSI恒溫培養(yǎng)箱，BCD-216TAM冰箱，TDL-5-A臺式離心機，UV2400/PC紫外可見分光光度計，DHG-9140B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，試管、錐形瓶、移液管等均為學(xué)院微生物實驗室常規(guī)儀器。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基[2]：用于菌種的活化、培養(yǎng)、保存和發(fā)酵。

1.1.4 試驗菌種

保加利亞乳桿菌G6（本課題組從市售酸乳中篩選出的一株高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌菌株，其胞外多糖產(chǎn)量為311.7 mg/L）。

1.2 方法

1.2.1 菌液吸光度的測定及活菌計數(shù)

將活化的保加利亞乳桿菌G6接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10 h后，取1 mL原液用無菌生理鹽水逐級稀釋，獲不同濃度的稀釋液，各稀釋液于600 nm波長下測其吸光值，取適宜濃度的稀釋液涂布MRS培養(yǎng)基平板，每個稀釋度平行3次，37℃培養(yǎng)48 h后計菌落數(shù)，繪制吸光度與活菌數(shù)的關(guān)系圖，通過吸光度的測定，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對應(yīng)的活菌數(shù)，以此獲得濃度為108mL-1菌懸液。

1.2.2 保加利亞乳桿菌G6胞外多糖質(zhì)量濃度的測定

（1）生長曲線的繪制。乳酸菌胞外多糖是由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種分泌于細(xì)胞外的次生代謝產(chǎn)物，是在對數(shù)期后期和穩(wěn)定期產(chǎn)生的。本試驗胞外多糖的測定時間為菌株達(dá)到穩(wěn)定期的時間。將保加利亞乳桿菌G6按3%的接種量（濃度為108mL-1）接種于裝有30 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫靜置培養(yǎng)，每2 h于600 nm波長下測其吸光值，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)作出保加利亞乳桿菌G6的生長曲線。

（2）胞外多糖的提取。取10 mL于37℃下培養(yǎng)至穩(wěn)定期的發(fā)酵液，4 000 r/min離心15 min，取上清液，用1 mol/L的NaOH將上清液調(diào)至7.5，加入1/10體積的胰蛋白酶液(濃度為3 g/L，現(xiàn)配現(xiàn)用)，40℃水浴酶解2.5 h。加入1/3體積Sevag液（氯仿：正丁醇(體積比)=3∶1），振搖30 min后，4 000 r/min離心15 min，去除沉淀，重復(fù)1次。加入3～5倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇，充分振蕩（多糖呈絮狀沉淀析出），4 000 r/min離心15 min，得沉淀。將沉淀用丙酮洗滌脫水兩次，干燥得白色粉末即為多糖（通過此種方法得到的為粗多糖）。

（3）胞外多糖質(zhì)量濃度的測定。采用苯酚-硫酸法測定質(zhì)量濃度，用葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[3]。EPS質(zhì)量濃度的測定：準(zhǔn)確吸取10 mL蒸餾水溶解胞外多糖樣品，吸取樣品溶液0.2 mL于試管中，然后按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備步驟操作，測定樣品的吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸直線方程求出對應(yīng)的糖濃度，再乘上樣品稀釋度即得保加利亞乳桿菌G6的胞外多糖濃度。

1.2.3 保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖影響因素的研究

（1）單因素實驗。以MRS液體培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基，改變碳源（葡萄糖）、氮源（蛋白胨）、磷酸鹽（磷酸氫二鉀），其他配方不變，考察營養(yǎng)基質(zhì)種類和質(zhì)量濃度對EPS產(chǎn)量的影響；改變初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間，考察發(fā)酵條件對EPS產(chǎn)量的影響。每組培養(yǎng)基的配方和試驗條件都取前面試驗優(yōu)化后的最佳營養(yǎng)要素和最佳發(fā)酵條件。

（2）正交實驗。 實驗設(shè)置4因素3水平，進(jìn)行L9（34）的正交試驗，4個因素均為單因素實驗中對胞外多糖產(chǎn)量影響較大的因素，3個水平均取單因素實驗的最佳值和左右值。其他實驗條件不變，采用相同的方法測定胞外多糖產(chǎn)量，確定出高產(chǎn)胞外多糖的最佳工藝條件。

（3）驗證實驗。采用最佳工藝條件進(jìn)行發(fā)酵，以相同的方法測定胞外多糖產(chǎn)量。平行3次，比較其EPS產(chǎn)量，并求出平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌液吸光度與活菌數(shù)關(guān)系

菌液吸光度與活菌數(shù)關(guān)系如圖1所示。由圖1可以看出，不同濃度稀釋液的吸光度與活菌數(shù)線性關(guān)系良好，通過測定各稀釋液的吸光度，就可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對應(yīng)的活菌數(shù)，以此獲得濃度為108mL-1菌懸液，保證各發(fā)酵試驗的接種量相對一致。

圖1 吸光度與活菌數(shù)關(guān)系

2.2 生長曲線

保加利亞乳桿菌G6的生長曲線如圖2所示。由圖2可以看出，保加利亞乳桿菌G6延滯期較短，4 h后進(jìn)入對數(shù)期，32 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。本研究確定保加利亞乳桿菌G6產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵時間為40 h。

圖2 保加利亞乳桿菌G6生長曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

2.3 保加利亞乳桿菌G6產(chǎn)胞外多糖影響因素

2.3.1 不同碳源對EPS產(chǎn)量的影響

碳源種類的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，葡萄糖為保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖的最優(yōu)碳源。葡萄糖質(zhì)量濃度的影響結(jié)果如圖5所示，由圖5可以看出，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為25 g/L時EPS產(chǎn)量最高。

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 碳源對EPS產(chǎn)量的影響

圖5 葡萄糖質(zhì)量濃度對EPS產(chǎn)量的影響

2.3.2 不同氮源對EPS產(chǎn)量的影響

氮源種類的影響結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，蛋白胨為保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖的最優(yōu)氮源。蛋白胨質(zhì)量濃度的影響如圖7所示，由圖7可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度為10 g/L時EPS產(chǎn)量最高。

圖6 氮源對EPS產(chǎn)量的影響

圖7 蛋白胨質(zhì)量濃度對EPS產(chǎn)量的影響

2.3.3 不同磷酸鹽對EPS產(chǎn)量的影響

磷酸鹽源種類的影響結(jié)果如圖8所示。由圖8可以看出，K2HPO4為保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖的最優(yōu)磷酸鹽源。K2HPO4質(zhì)量濃度的影響結(jié)果如圖9所示，由圖9可以看出，當(dāng)K2HPO4質(zhì)量濃度為3.0 g/L時EPS產(chǎn)量最高。

圖8 磷酸鹽對EPS產(chǎn)量的影響

圖9 K2HPO4質(zhì)量濃度對EPS產(chǎn)量的影響

2.3.5 不同初始pH值對EPS產(chǎn)量的影響

初始pH的影響結(jié)果如圖10所示。由圖10可以看出，當(dāng)pH值為4.5～6.0時，胞外多糖產(chǎn)量隨pH值的升高而增大，當(dāng)pH值為6.0～7.0時，胞外多糖產(chǎn)量隨pH值的增大而減小，pH值為6.0時胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最高值。這是因為低或高的pH值，既不利于乳酸菌生長，亦不利于胞外多糖產(chǎn)量的積累。故本試驗的初始pH值初步確定為6.0。

2.3.6 溫度對EPS產(chǎn)量的影響

發(fā)酵溫度的影響結(jié)果如圖11所示。由圖11可以看出，當(dāng)溫度小于36℃時，乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量隨溫度的升高而增大，當(dāng)溫度高于36℃時，乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量隨溫度的升高而減小。這是因為菌體在相對較低的溫度下，細(xì)胞的生長和細(xì)胞壁的合成較慢，有利于胞外多糖的合成。故本試驗的發(fā)酵溫度初步確定為36℃。

圖10 初始pH值對EPS產(chǎn)量的影響

圖11 發(fā)酵溫度對EPS產(chǎn)量的影響

2.3.7 不同發(fā)酵時間對EPS產(chǎn)量的影響

發(fā)酵時間的影響結(jié)果如圖12所示。由圖12可以看出，38 h以前隨發(fā)酵時間的延長，胞外多糖產(chǎn)量增大，38 h以后隨發(fā)酵時間的延長，胞外多糖產(chǎn)量隨時間的延長而減小?？赡苁前舛嗵窃诰晟L過程中會逐漸被分解成單糖補充碳源使菌株繼續(xù)生長[4]。故本研究的發(fā)酵時間初步確定為38 h。

圖12 發(fā)酵時間對EPS產(chǎn)量的影響

2.3.8 正交實驗

由于氮源、磷酸鹽質(zhì)量濃度對保加利亞乳桿菌G6產(chǎn)胞外多糖的影響較小，故僅對葡萄糖質(zhì)量濃度、發(fā)酵溫度、初始pH值和發(fā)酵時間進(jìn)行L9（34）的正交實驗，結(jié)果如表1所示。以胞外多糖產(chǎn)量作為考察指標(biāo)，確定出保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖的最佳工藝條件。

由表1可以看出，四因素對保加利亞乳桿菌G6產(chǎn)胞外多糖的影響大小為：葡萄糖質(zhì)量濃度＞初始pH值＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間。從K值可知，保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖的最佳工藝條件為A3B1C1D1，即葡萄糖質(zhì)量濃度為30 g/L，發(fā)酵溫度為34℃，初始pH值為5.5，發(fā)酵時間為36 h。

表1 正交實驗結(jié)果

2.3.9 最佳工藝條件的驗證實驗

采用最佳工藝條件進(jìn)行發(fā)酵，即配制葡萄糖30 g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸氫二鉀3.0 g/L，pH值為5.5的MRS液體培養(yǎng)基，于34℃靜置培養(yǎng)36 h。平行3次，結(jié)果如表2所示。

表2 驗證試驗結(jié)果

由表2可以看出，保加利亞乳桿菌G6胞外多糖產(chǎn)量為425.7 mg/L，比優(yōu)化前提高了36.57%。3次測定結(jié)果表明，此最佳工藝條件具有合理性和穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

（1）對保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖的影響因素進(jìn)行了研究，在MRS液體培養(yǎng)基中，當(dāng)葡萄糖、蛋白胨和磷酸氫二鉀的質(zhì)量濃度分別為30，10，3.0 g/L，而初始pH值為5.5，發(fā)酵溫度34℃，發(fā)酵時間36 h時，該菌株胞外多糖合成量為425.7 mg/L，比優(yōu)化前提高了36.57%。3次驗證試驗說明此工藝條件具有合理性和穩(wěn)定性。

（2）實驗證明，營養(yǎng)基質(zhì)碳源、氮源和磷酸鹽的種類和質(zhì)量濃度對保加利亞乳桿菌G6產(chǎn)EPS都有不同程度的影響。不同的發(fā)酵條件，得到不同的胞外多糖產(chǎn)量。保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵溫度較低，菌體在進(jìn)入穩(wěn)定期后多糖產(chǎn)量最高，培養(yǎng)基在酸性環(huán)境下，EPS生物合成量較大。

（3）本研究可為高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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