孫常雁，李德海，劉騫，孔保華

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) a.食品學(xué)院，哈爾濱 150030；b.黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，哈爾濱150028；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040）

0 引 言

美拉德反應(yīng)能提高天然蛋白質(zhì)、肽及氨基酸的乳化性[1]、溶解性[2]、熱穩(wěn)定性[3]、抗菌性[4]、抗癌性[5]、抗氧化活性[6]和抗過(guò)敏性[7]等。但由于MRPs分子組成很復(fù)雜，需要分級(jí)分離研究，目前多采用膜法進(jìn)行分離。楊曉泉等[8]利用切向流超濾膜對(duì)大豆蛋白肽進(jìn)行了分級(jí)分離并研究其功能性的變化；黃文凱[9]對(duì)大豆肽液超濾和納濾脫鹽的分離特性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究；Feng等[10]使用膜將酪蛋白-葡萄糖MRPs分成多個(gè)分子量范圍并研究其抗氧活性的差異；徐獻(xiàn)兵等[11]采用超濾膜分離技術(shù)研究不同分子量段MRPs的特性。

本研究利用不同分子截留量的超濾膜對(duì)WPPMRPs進(jìn)行了分級(jí)分離，目的是分析其抗氧化活性隨分子量分布的變化規(guī)律，為WPP-MRPs在功能食品和藥品中的應(yīng)用提供可行的依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試驗(yàn)原料、試劑與儀器

乳清蛋白，ABTS（2,2'-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽），抗壞血酸（Vc）、丁基羥基茴香醚（BHA）、鄰苯二酚紫、硫酸亞鐵、磷酸鹽緩沖液（PBS）、無(wú)水乙醇。

紫外可見分光光度計(jì)TU－1800，高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，R-205B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，超濾膜分離設(shè)備，電子天平，恒溫水浴鍋。

1.2 WPP-MRPs的制備

參照本實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[12]，準(zhǔn)確稱取乳清蛋白配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的乳清蛋白溶液、經(jīng)95℃預(yù)熱5 min，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值到8.5，加入堿性蛋白酶，酶與底物比為2∶100(即每100 g的乳清蛋白底物所需要的堿性蛋白酶的體積為2 mL)，水浴55℃下振蕩水解，反應(yīng)過(guò)程中不斷加入濃度為1 mol/L的NaOH，使pH值保持8.5，水解5 h，之后煮沸5 min滅酶活。

將水解后的乳清蛋白抗氧化肽，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的葡萄糖，在一定溫度和磁力攪拌（40 r/min）下加熱，反應(yīng)一定時(shí)間后立即用冰水混合物迅速降溫，終止反應(yīng)，樣品經(jīng)1 000 g離心10 min，除去沉淀，上清液凍低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥為粉末備用。

1.3 不同分子量分布范圍的WPP-MRPs的分級(jí)

利用中空纖維超濾膜將1.2中制備的WPP-MRPs混合物上清液進(jìn)行超濾分級(jí)，使其先后通過(guò)截留分子量為5 ku及0.8 ku的的超濾膜進(jìn)行截流分段，溫度為20℃,壓力為0.1 MPa， 得到I（分子量＜0.8 ku）、II（0.8 ku＜分子量＜5 ku）、III （分子量＞5 ku）3個(gè)不同分子量等級(jí)WPP-MRPs，然后低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥為粉末備用。

1.4 WPP-MRPs抗氧化活性測(cè)定

抗氧化能力包括總鐵還原能力、ABTS自由基清除能力、羥基自由基清除、硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)（Thiobarbituric acid-reactive substances,TBARS）、 對(duì)金屬離子螯合能力。分別測(cè)定I、II、III部分WPPMRPs和不分段的WPP-MRPs混合物的抗氧化活性各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4.1 總還原能力測(cè)定

參照Kanokwan［13］的方法。分別取樣品溶液0.5 mL(質(zhì)量濃度為10，20，30，40，50，60，70 g/L)，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(濃度為0.2 mol/L，pH值為6.6)和2.5 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻。再將混合物在50℃下水浴保持20 min后急速冷卻，加入2.5 mL的10%的三氯乙酸溶液，然后將混合物在3 360 g下離心10 min。取2.5 mL上層清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的氯化鐵溶液，混合均勻，放置10 min后，在700 nm處測(cè)定其吸光值。以Vc為對(duì)照，研究WPP-MRPs的還原能力。

1.4.2 ABTS自由基清除的測(cè)定

參照Ozgen[14]的方法并略有改動(dòng)，分別將WPPMRPs配制成質(zhì)量濃度為10，20，30，40，50，60，70 g/L的樣品溶液。濃度為7.0 mmol/L的ABTS溶液與終濃度為2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀混合，室溫避光放置12～16 h。用pH值為4.5的乙酸鈉溶液（濃度為20 mmol/L）稀釋至波長(zhǎng)734 nm處的吸光度為0.7±0.02。取3 mL該溶液與20 μL樣品液混合，放置6 min，于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度，以Vc為對(duì)照，研究WPP-MRPs的清除ABTS自由基能力。按照下式計(jì)算ABTS自由基清除率為

式中：Ac為對(duì)照的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.4.3 ·OH自由基清除能力的測(cè)定

參照Wang[15]的方法稍作改進(jìn)，分別將WPP-MRPs配制成質(zhì)量濃度為10，20，30，40，50，60，70 g/L的樣品溶液。在試管中依次加入濃度為6 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，濃度為6 mmol/L的H2O2溶液1mL和樣品溶液1 mL，搖勻，靜置10 min，再加入濃度為6 mmol/L的水楊酸溶液1 mL，搖勻，靜置30 min后于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。以乙醇溶液代替待測(cè)液作空白對(duì)照，測(cè)定吸光度。以Vc為對(duì)照，研究WPP-MRPs的清除羥自由基能力。清除率為

·OH清除率=[1-（A1-A0）/A]×100%，

式中：A為空白對(duì)照的吸光度；A0為無(wú)水楊酸時(shí)加入樣品液的吸光度；A1為加入樣品液的吸光度。

1.4.4 對(duì)金屬離子的螯合能力

參照Guo[16]的方法稍作修改進(jìn)行研究。Cu2+的螯合：用鄰苯二酚紫作為金屬螯合指示劑。向1 mL濃度為2 mmol/L的CuSO4溶液、1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的吡啶與20 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的鄰苯二酚紫混合物中添加1 mL的乳清蛋白水解物，鄰苯二酚紫與CuSO4結(jié)合形成藍(lán)色物質(zhì)，在有螯合劑存在時(shí)鄰苯二酚紫與Cu2+離子分離，溶液藍(lán)色消失。鄰苯二酚紫溶液顏色的變化可以在632 nm處測(cè)得。

對(duì)于Fe2+的螯合：1 mL濃度為20 μmol/L的FeCl2與1 mL濃度為0.5 mmol/L的ferrozine混合后會(huì)產(chǎn)生一種物質(zhì)，在562 nm處有強(qiáng)吸收。向其中添加0.5m L的乳清蛋白水解物，由于Fe2+被螯合，溶液顏色發(fā)生變化，在562 nm下讀取吸光值。

螯合作用=[1-(樣品溶液的吸光值/空白溶液的吸光值)]×100。

1.4.5 硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)的測(cè)定

第一步：脂肪氧化體系(Liposome)的制備

卵磷脂脂質(zhì)體氧化體系 (soybean phosphatidylcholine liposome)，采用Decker和 Hultin[17]的方法并進(jìn)行一些改進(jìn)。將大豆卵磷脂（質(zhì)量濃度0.2 g/L）溶解在濃度為0.12 mol/L的KCl溶液，濃度為5 mmol/L組氨酸緩沖溶液 (pH值為 6.8)均質(zhì)后，在4°C進(jìn)行超聲波降解45 min。為測(cè)定樣品的抗氧化活力，準(zhǔn)備一系列5 mL脂質(zhì)體和1 mL各種待測(cè)樣品進(jìn)行試驗(yàn)。陰性對(duì)照用1 mL水代替1 mL樣品溶液與5 mL脂質(zhì)混合，同時(shí)以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的BHA作為陽(yáng)性對(duì)照。脂質(zhì)氧化由鐵的氧化還原反應(yīng)引發(fā)，將0.1 mL濃度為50 mmol/L的FeCl3和0.1 mL濃度為10 mmol/L抗壞血酸鹽加入脂質(zhì)/蛋白溶液（6 mL）中。樣品在37°C 水浴中保溫1 h，并迅速通過(guò)測(cè)定硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì) （TBARS）研究脂肪氧化情況。

第二步：硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)的測(cè)定

TBARS的測(cè)定，參照Sinnhuber和Yu[18]的方法，并作適當(dāng)?shù)男薷?。? mL樣品加入3 mL硫代巴比妥酸溶液、17 mL三氯乙酸-鹽酸溶液，混勻后，沸水浴中反應(yīng)30min，冷卻，取5 mL樣品加入等體積的氯仿，3000 r/min下離心10 min，532 nm下讀取吸光值。TBARS值以每升脂質(zhì)氧化樣品溶液中丙二醛的毫克數(shù)表示。計(jì)算為

TBARS(mg/kg)=(A532/Vs)× 9.48，

式中A532為溶液的吸光值；Vs為樣品的體積；9.48為常數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)中測(cè)定結(jié)果重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果表示為平均數(shù)±SD。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1(分析軟件,St Paul,MN)軟件包中Linear Models程序進(jìn)行，差異顯著性(P＜0.05)分析使用Tukey HSD程序，采用sigmaplot9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 WPP-MRPs總還原能力分析

測(cè)定總還原能力實(shí)質(zhì)是基于氧化還原反應(yīng)的比色法，非酶抗氧化劑可以看作還原劑，把氧化物質(zhì)還原，從而起到抗氧化劑的作用。本試驗(yàn)以不同濃度的天然抗氧化劑Vc作為對(duì)照，評(píng)價(jià)WPP-MRPs混合物及不同分子量分布范圍Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的總還原能力。

圖1 WPP-MRPs的還原能力

由圖1可以看出，WPP-MRPs、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Vc均隨著質(zhì)量濃度的增加，A700值增大，表明還原能力隨之增大，而且還原能力與其濃度成量效關(guān)系。其中質(zhì)量濃度在10～70 g/L之間，Ⅱ的還原能力顯著高于相同質(zhì)量濃度WPP-MRPs、Ⅰ、Ⅲ及Vc的還原能力（P＜0.05），但是WPP-MRPs混合物的還原能力高于相同濃度Ⅰ、Ⅲ的還原能力，說(shuō)明具有較好還原力的WPP-MRPs分子量分布在0.8～5 ku之間。當(dāng)質(zhì)量濃度為70 g/L時(shí)，Ⅱ的A700值為1.551±0.06，WPP-MRPs的A700值為1.26±0.07，分別相當(dāng)于質(zhì)量濃度為212.9 mg/L和173.2 mg/L Vc的還原力。結(jié)果表明，Ⅱ分子量分布在0.8～5 ku之間的WPP-MRPs具有較強(qiáng)的還原能力。

Ames 等[19]將MRPs分為兩大類：一種是由2～4個(gè)含有多個(gè)共軛雙鍵的環(huán)狀物組成的中低分子量化合物，另一種是量具有發(fā)色基團(tuán)的較高分子的褐色聚合物-類黑精。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有一定的還原能力，原因可能為反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生了大量褐色素以及還原酮、吡咯酮、脫氧果糖嗪類等能夠提供氫電子的物質(zhì)[20]，而氫電子具有還原性，可將Fe3+還原為Fe2+，F(xiàn)e2+進(jìn)一步發(fā)生Perl’s Prussian反應(yīng)從而表現(xiàn)出還原能力[21]。Eichner等[22]發(fā)現(xiàn)MRPs中等分子量的還原酮類化合物可通過(guò)羥基提供電子破壞自由基鏈，表現(xiàn)出較好的還原性。

2.2 WPP-MRPs的ABTS自由基清除能力分析

以不同質(zhì)量濃度的天然抗氧化劑Vc作為對(duì)照，不同分子量的WPP-MRPs的ABTS自由基清除能力。

圖2 WPP-MRPs的ABTS自由基清除能力

由圖2可以看出，對(duì)比5種溶液，可以發(fā)現(xiàn)乳清蛋白肽美拉德反應(yīng)物具有較好的清除ABTS自由基能力，可很清楚的看到分段之后，Ⅱ段分子量的美拉德產(chǎn)物清除ABTS自由基的能力略高于Ⅰ段、Ⅲ段和WPP-MRPs的混合物，尤其當(dāng)Ⅱ段質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí)，清除率可達(dá)91.49%±3.04%，說(shuō)明在0.8 ku＜分子量＜5ku的WPP-MRPs具有較強(qiáng)的自由基清除能力。

很多文獻(xiàn)證明了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有清除ABTS自由基的能力。Hayase等人[23]研究表明木糖與蛋白的MRPs對(duì)ABTS自由基有很好的清除能力；Wagner等人[24]研究了以葡萄糖為模型MRPs也具有較強(qiáng)的ABTS自由基清除能力；另外Nienaber[25]發(fā)現(xiàn)抗氧化活性物質(zhì)主要存在于無(wú)色的中低分子量MRPs中，此結(jié)論恰好與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3 羥基自由基清除能力分析

本研究以不同質(zhì)量濃度的天然抗氧化劑Vc作為對(duì)照，評(píng)價(jià)不同分子量分布范圍乳清蛋白肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物羥基自由基清除能力。

圖3 WPP-MRPs的羥基自由基清除能力

由圖3可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度在10～40 g/L之間時(shí)，WPP-MRPs對(duì)羥基自由基清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而快速增大（P＜0.05），但是質(zhì)量濃度在50～70 g/L范圍內(nèi)，WPP-MRPs對(duì)羥基自由基清除能力隨著濃度的增幅減小，即增加不顯著（P＞0.05）。而質(zhì)量濃度在10～70 mg/L范圍內(nèi)，Vc對(duì)羥基自由基清除能力隨著濃度的增加而增大，具有量效關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí)Ⅱ段WPP-MRPs對(duì)羥基自由基清除能力99.36%±3.25%，相當(dāng)于質(zhì)量濃度為330.2 mg/L的Vc對(duì)羥基自由基清除能力。結(jié)果表明，WPP-MRPs具有較好的清除羥基自由基能力。

Lusani等[26]研究表明賴氨酸與果糖反應(yīng)產(chǎn)物具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力，羥自由基是活性極強(qiáng)的自由基，幾乎可以與細(xì)胞內(nèi)一切有機(jī)物反應(yīng)，表現(xiàn)在使核酸斷裂、多糖解聚和不飽和脂肪酸過(guò)氧化作用，導(dǎo)致遺傳突變、膜損傷、酶失活、線粒體氧化磷酸化作用等一系列變化，進(jìn)而損傷細(xì)胞的機(jī)構(gòu)和功能。

2.4 金屬離子螯合能力分析

許多過(guò)渡金屬離子都能促進(jìn)體內(nèi)氧化的進(jìn)行，它們可以催化超氧陰離子產(chǎn)生羥自由基，造成肌體的氧化衰老，而抗氧化劑可以通過(guò)螯合金屬離子，間接阻止體內(nèi)自由基的形成，從而達(dá)到抗氧化的目的。本試驗(yàn)選擇了銅離子和亞鐵離子兩種金屬離子來(lái)測(cè)定美拉德產(chǎn)物不同組分的抗氧化活性。

圖4 WPP-MRPs亞鐵離子螯合率

各組分亞鐵離子螯合率如圖4。由圖4可以看出，隨著WPP-MRPs質(zhì)量濃度的增高，螯合亞鐵的能力均略有升高；當(dāng)質(zhì)量濃度在10～60 g/L之間時(shí)，Ⅲ段的亞鐵離子螯合率明顯高于其他組分；在最大質(zhì)量濃度70 g/L下，Ⅱ和Ⅲ段的亞鐵離子螯合率達(dá)到最高15.65%±1.3%和15.97%±0.7%，二者差異不顯著（P＞0.05），可見大分子的WPP-MRPs對(duì)亞鐵離子的螯合能力較強(qiáng)。

圖5 WPP-MRPs銅離子(Cu2+)螯合率

對(duì)比圖4和圖5，可以看出WPP-MRPs對(duì)銅離子的螯合率明顯高于亞鐵離子，且兩個(gè)圖中的WPP-MRPs對(duì)金屬螯合能力均明顯高于Vc溶液，該項(xiàng)指標(biāo)也反映了抗氧化活性的大小，如Jing等[27]提出糖-賴氨酸的MRPs表現(xiàn)抗氧化活性可能通過(guò)螯合金屬離子。

螯合金屬能力的差異可能是由于MRPs組分復(fù)雜多樣，國(guó)內(nèi)外也有相應(yīng)的研究，Tan等[28]發(fā)現(xiàn)MRPs中具有較強(qiáng)的螯合能力的化合物為還原酮類，Hofmann[29]報(bào)道了金屬離子螯合能力主要與MRPs中的大分子物質(zhì)相關(guān)，Eiserich[30]認(rèn)為雜環(huán)化合物也具有很強(qiáng)的螯合鐵離子能力。本研究表明WPP-MRPs中抗氧化性較強(qiáng)的物質(zhì)是Ⅱ、Ⅲ段即分子量M＞0.8 ku段，原因可能為該分子量中含有較多還原酮結(jié)構(gòu)和雜環(huán)化合物；并且分子量M＜0.8 ku的肽段主要成分是小分子量的WPPMRPs及肽、氨基酸和葡萄糖，其螯合金屬能力較差。

2.5 TBARS的分析

食品中的脂類非常容易氧化，發(fā)生此變化的原因也很復(fù)雜，原因可能是金屬離子產(chǎn)生的促氧化作用，也有可能是某些自由基本身的促氧化作用，因此，WPP-MRPs的抑制脂質(zhì)氧化可能二者兼而有之。以不同濃度的抗氧化劑BHA作為對(duì)照，WPP-MRPs對(duì)卵磷脂脂質(zhì)氧化的抑制作用。

圖6 WPP-MRPs的TBARS的抑制作用

由圖6可以看出，各組分WPP-MRPs均有一定的對(duì)脂質(zhì)抗氧化能力，隨著質(zhì)量濃度的增大，脂質(zhì)抗氧化能力不斷增加，但質(zhì)量濃度超過(guò)50 g/L時(shí)，抗氧化能力趨于平緩。分子量為0.8 ku＜分子量＜5 ku反應(yīng)物的抗氧化能略高與其他組分，在質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí)，WPP-MRPs、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的TBARS值分別為1.02±0.09，0.83±0.07，0.73 ±0.07和（0.79±0.03）mg/L，差異不顯著（P＞0.05）。 Rao等[31]研究證實(shí)了殼聚糖、葡萄糖的美拉德產(chǎn)物具有一定的抑制脂肪氧化作用；目前肽類MRPs對(duì)脂質(zhì)氧化的抑制研究較少，Miranda[32]研究了不同氨基酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的脂質(zhì)抗氧化效果，結(jié)果為精氨酸-MRPs＞纈氨酸-MRPs＞組氨酸-MRPs。

本研究可以清晰的看出BHA具有較強(qiáng)的脂質(zhì)抗氧化能力，其效果明顯高于MRPs，但WPP-MRPs作為普通食品原料，具有一定的脂質(zhì)抗氧化能力，還將有廣闊的應(yīng)用空間。

3 結(jié) 論

本研究表明經(jīng)過(guò)中空纖維超濾膜分級(jí)的WPPMRPs均具有一定抗氧化活性，且隨著質(zhì)量濃度的增加其抗氧化能力也增強(qiáng)，其中Ⅱ的總還原力、ABTS自由基清除能力和羥基自由基清除能力在同等濃度條件下較Ⅰ和Ⅲ高，而金屬螯合能力主要是分子量較大的Ⅲ表現(xiàn)出較好的螯合率，TBARS值為Ⅱ級(jí)具有一定的抑制脂肪氧化能力。本試驗(yàn)同時(shí)與Vc或BHA進(jìn)行比較，通過(guò)增加WPP-MRPs濃度可以達(dá)到Vc或BHA的抗氧化效果，說(shuō)明WPP-MRPs作為食品原料在抗氧化劑領(lǐng)域中應(yīng)用具有廣闊的開發(fā)前景。

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