劉步云，王永麗，于奇建，劉 芳，臧金紅，金鈴和，李大鵬，李 鋒,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

兒茶素屬黃烷醇類化合物，是茶葉中主要的活性成分之一，約占茶多酚總量的60%～80%。研究表明兒茶素具有很強的抗氧化活性[1]，以及防癌抗癌、抗突變、廣譜抑菌、免疫調(diào)節(jié)和保護心血管等多種功效[2-3]，因此，在食品、醫(yī)藥和精細化工等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。但是，兒茶素在生理水相環(huán)境中極不穩(wěn)定，易聚合或異構(gòu)化；其含有的多個酚羥基與水分子之間也易形成氫鍵，從而導致兒茶素脂溶性差，大大降低了其在體內(nèi)的吸收和利用率[4]。而且，兒茶素進入人體后半衰期很短，90%以上的兒茶素在體內(nèi)發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化或由糞便或尿液排出，顯著降低了其生物學功能[5]。

近年來，納米粒子已經(jīng)成為營養(yǎng)素及藥物新劑型研究中非?；钴S的領(lǐng)域?；诓煌椒ㄖ苽涞募{米載體具有良好的生物相容性、緩釋性及靶向性，能夠有效提高營養(yǎng)素及藥物的穩(wěn)定性和生物利用率。在食品領(lǐng)域，納米載體已用作維生素、礦物質(zhì)、多肽、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物的新型輸送載體[6]。同時，應(yīng)用納米粒遞送5-氟尿嘧啶[7]、紫杉醇[8]、阿霉素[9]等抗腫瘤藥物的研究也有報道。葉酸受體在多數(shù)人體腫瘤細胞表面過度表達，而在正常細胞中很少或不表達，通過對藥物載體進行葉酸偶聯(lián)，可以增強藥物與腫瘤細胞的靶向性結(jié)合，減少藥物對正常細胞的毒副作用，從而提高藥物的選擇性和利用率[10]。

目前，關(guān)于通過葉酸修飾的納米載體對兒茶素進行靶向輸送的研究尚未見報道。本研究擬通過化學反應(yīng)制備葉酸偶聯(lián)殼聚糖，然后以兒茶素為載藥，利用分子自組裝原理制備載兒茶素葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒，通過響應(yīng)面法研究影響兒茶素包封率的因素并進行工藝優(yōu)化，研究結(jié)果將為新型兒茶素輸送載體的研究開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葉酸（≥99%）、兒茶素（≥98%） 美國Sigma公司；殼聚糖（脫乙酰度≥95%，食品級）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）、無水二甲基亞砜、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、丙酮、氫氧化鈉、醋酸等均為分析純 上海阿拉丁試劑公司。

透析袋（截留分子質(zhì)量3 500 D） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；78-1磁力加熱攪拌器 常州智博瑞儀器制造有限公司；TGL-18高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；754N紫外分光光度計 上海奧譜勒儀器有限公司；PHS-3E pH計 上海精密科學儀器有限公司；VERTEX70傅里葉紅外光譜儀 德國布魯克公司；FreeZone2.5冷凍干燥機 美國Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 葉酸偶聯(lián)殼聚糖（folate chitosan conjugates，F(xiàn)A-CS）的制備[11]

稱取2.648 4 g葉酸和2.683 8 g 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，溶于100 mL無水二甲基亞砜，室溫下避光磁力攪拌至葉酸全部溶解。稱取2.648 4 g殼聚糖，溶于pH 4.7的0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，充分攪拌，配制得到質(zhì)量分數(shù)為0.5%的殼聚糖溶液。將上述葉酸混合溶液逐滴加入殼聚糖溶液中，并持續(xù)攪拌16 h。待反應(yīng)結(jié)束后，加入1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值至9.0。然后依次用PBS（pH 7.4）、蒸餾水透析3 d，冷凍干燥得到淡黃色的FA-CS粉末。

1.3.2 葉酸偶聯(lián)比的計算[12]

1.3.2.1 葉酸標準曲線的繪制

準確稱取6.3 mg葉酸，用醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.8）溶解，并定容至50 mL。精確量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL上述葉酸溶液，分別置于10 mL容量瓶中，用醋酸-醋酸鈉緩沖液定容至刻度，各管中葉酸的質(zhì)量濃度分別為0.006 3、0.012 6、0.018 9、0.025 2、0.031 5、0.037 8 mg/mL。以醋酸-醋酸鈉緩沖液為對照溶液，用紫外分光光度計在358 nm波長處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，葉酸的質(zhì)量濃度C為橫坐標，制作標準曲線并得其回歸方程為：A=0.010 3C+0.017 9（R2=0.996 3）。

1.3.2.2 偶聯(lián)比的計算

稱取一定質(zhì)量凍干后的FA-CS，溶解于醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.8），并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，于358 nm波長處測定其吸光度，空白溶液同上法制備。按如下公式計算每毫克FA-CS中葉酸的含量，即為偶聯(lián)比。

式中：mFA為根據(jù)標準曲線計算出的葉酸質(zhì)量/mg；mFA-CS為稱取的FA-CS的質(zhì)量/mg。

1.3.3 載兒茶素葉酸偶聯(lián)殼聚糖（Catechin-FA-CS）納米粒的制備

參照Wan等[13]方法并稍作修改。稱取一定質(zhì)量的FA-CS溶解于2%醋酸溶液中配制成1.0 mg/mL的FA-CS溶液。稱取6.4 mg的兒茶素，溶解于16 mL上述FA-CS溶液中。然后用質(zhì)量分數(shù)為1%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至5.0，攪拌條件下將2 mL 2.0 mg/mL的TPP溶液以3 s每滴的速度滴入上述FA-CS溶液中，并持續(xù)攪拌30 min，即得Catechin-FA-CS納米粒懸浮液。將混懸液于16 000 r/min離心30 min，收集沉淀物，冷凍干燥、－20℃保存。

1.3.4 兒茶素包封率的測定

1.3.4.1 兒茶素標準曲線的繪制

采用香草醛-鹽酸比色法[14]測定兒茶素含量。準確稱取兒茶素標準品5.0 mg，用蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL棕色容量瓶中并定容至刻度，配制0.1 mg/mL的貯備液。精確量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mL的貯備液至10 mL的棕色容量瓶中，分別加1 mL水，用質(zhì)量分數(shù)為1%的香草醛-鹽酸溶液定容至刻度，搖勻靜置30 min，作為待測液。空白溶液同上法制備。在503 nm波長處分別測定其吸光度，得到兒茶素吸光度-質(zhì)量濃度標準曲線方程為：A=0.085 5C+0.081 9（R2=0.996 1）。

1.3.4.2 兒茶素包封率的計算

將Catechin-FA-CS納米粒懸浮液于16 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min后，收集上清液。按照上述的香草醛-鹽酸比色法操作步驟，于503 nm波長處測定其吸光度。按如下公式計算兒茶素包封率：

式中：M總為兒茶素的初始質(zhì)量/mg；M游為根據(jù)標準曲線計算的上清液中兒茶素質(zhì)量/mg。

1.3.5 紅外光譜分析[15]

將兒茶素、CS、FA-CS和Catechin-FA-CS納米粒凍干粉末，使用溴化鉀壓片法壓片，在紅外光譜分析儀中進行紅外光譜測試。

1.3.6 透射電鏡觀察粒子形態(tài)[16]

取一滴懸浮液，用質(zhì)量分數(shù)2%的磷鎢酸染色劑染色2～3 min，然后置于鋪有碳支持膜的銅網(wǎng)上，用濾紙吸去多余染液，自然干燥后，置于Hitachi-7650透射電鏡下觀察，設(shè)定加速電壓為80 kV。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 單因素試驗

稱取6.4 mg的兒茶素，設(shè)定兒茶素與FA-CS質(zhì)量比為2∶5，F(xiàn)A-CS與TPP質(zhì)量比為4∶1，反應(yīng)pH 5.0，攪拌時間30 min，固定其他條件分別考察兒茶素與FA-CS質(zhì)量比（1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、5∶5）、FA-CS與TPP質(zhì)量比（2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1）、反應(yīng)pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）和攪拌時間（10、20、30、40、50 min）對兒茶素包封率的影響。

1.4.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定因素水平范圍，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，以兒茶素包封率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0軟件在四因素三水平上對兒茶素/FA-CS質(zhì)量比、FA-CS/TPP質(zhì)量比、反應(yīng)pH值和攪拌時間進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 FA-CS的制備及結(jié)構(gòu)驗證

2.1.1 葉酸偶聯(lián)比的計算

經(jīng)測定葉酸偶聯(lián)比為0.258，根據(jù)其分子質(zhì)量計算可知每個FA-CS分子上大約偶聯(lián)了30個葉酸分子。根據(jù)文獻報道，在葉酸-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物上平均一個蛋白質(zhì)分子上偶聯(lián)3個葉酸分子已有較強的靶向性[17]。

2.1.2 FA-CS的紅外光譜分析

如圖1所示，葉酸的紅外吸收峰主要在3 419.4、1 694.5、1 604.5、1 485.0 cm－1處，分別對應(yīng)葉酸中N—H、C＝O、蝶啶環(huán)上的氨基、C＝C或C＝N的振動吸收峰。殼聚糖主要在3 358.3、1 593.4 cm－1和1 069.2 cm－1處，分別對應(yīng)—NH2和6位—OH共同作用的振動吸收峰、伯胺的N—H面內(nèi)變形振動吸收和醚鍵C—O—C伸縮振動吸收。與殼聚糖相比，F(xiàn)A-CS最明顯的變化是在1 604.3 cm－1處出現(xiàn)酰胺鍵的強吸收峰，1 512.2 cm－1處出現(xiàn)了仲胺N—H鍵的彎曲振動吸收，這表明葉酸中的羧基與殼聚糖的氨基發(fā)生反應(yīng)，生成了酰胺鍵[18]，葉酸已成功偶聯(lián)于殼聚糖上。

圖1 葉酸、殼聚糖和葉酸偶聯(lián)殼聚糖的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of folic acid, chitosan and FA-CS

2.2 單因素試驗

2.2.1 FA-CS/TPP質(zhì)量比對兒茶素包封率的影響

圖2 FA-CS/TPP質(zhì)量比對兒茶素包封率的影響Fig.2 Effect of FA-CS/TPP mass ratio on encapsulation efficiency of catechin

由圖2可知，隨著FA-CS/TPP質(zhì)量比增大，兒茶素的包封率逐漸增大，當FA-CS/TPP質(zhì)量比是4∶1時，包封率達到最大值，然后呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。這可能是因為納米顆粒的形成是基于殼聚糖鏈中帶正電的氨基與TPP中多聚陰離子之間的離子凝膠化作用[19]。當TPP濃度過高時，兩者之間的離子作用太強，不利于納米顆粒的形成和分散；而當TPP濃度過低時，多聚陰離子的量又不足以與殼聚糖中氨基發(fā)生離子凝膠化作用形成納米顆粒。故選擇FA-CS/TPP的質(zhì)量比為4∶1。

2.2.2 兒茶素/FA-CS質(zhì)量比對兒茶素包封率的影響

圖3 兒茶素/FA-CS質(zhì)量比對兒茶素包封率的影響Fig.3 Effect of catechin/FA-CS mass ratio on encapsulation efficiency of catechin

由圖3可知，在兒茶素/FA-CS質(zhì)量比為1∶5時，兒茶素包封率較低；隨著兒茶素/FA-CS質(zhì)量比增大，兒茶素包封率迅速上升后又緩慢下降。當兒茶素/FA-CS質(zhì)量比是2∶5時，包封率達到最大值23.11%。原因可能是在兒茶素質(zhì)量濃度很低的情況下，兒茶素在殼聚糖離子凝膠形成納米粒時，由于體積排阻作用被排斥到顆粒以外，導致包封率較低。但投藥量較高時，由于納米粒的載藥能力有限，繼續(xù)增加投藥量會使兒茶素包封率減小[20]。故選擇兒茶素/FA-CS的質(zhì)量比為2∶5。

圖4 pH值對兒茶素包封率的影響Fig.4 Effect of pH on encapsulation efficiency of catechin

2.2.3 pH值對兒茶素包封率的影響由圖4可知，pH值在3.0～7.0范圍內(nèi)，兒茶素包封率隨著pH值升高先升高后下降，當pH值為5.0時達到最大值；隨著pH值的進一步升高，包封率逐漸下降。原因可能是在pH值較低時，會減少TPP多聚陰離子，降低納米粒的交聯(lián)程度，導致兒茶素包封率較低；但pH值過高時，會極大地影響FA-CS中氨基的離子化程度，降低FA-CS正電荷數(shù)目，同樣會致使兒茶素包封率較低[21]。故選擇FA-CS溶液的pH值為5.0。

2.2.4 攪拌時間對兒茶素包封率的影響

圖5 攪拌時間對兒茶素包封率的影響Fig.5 Effect of stirring time on encapsulation efficiency of catechin

由圖5可知，攪拌時間在10～50 min范圍內(nèi)，兒茶素包封率先上升后下降，30 min時達到最高值；30～40 min時，包封率迅速下降；40～50 min時包封率下降較為平緩。這說明FA-CS與TPP的離子交聯(lián)反應(yīng)可能是一個較快的過程，在短時間內(nèi)就能完成；隨著攪拌時間的延長，已經(jīng)包封的兒茶素有可能因攪拌作用而從納米粒中分散出來[22]，致使包封率下降。故選擇攪拌時間為30 min。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化Catechin-FA-CS制備工藝

2.3.1 響應(yīng)面法分析因素水平的選取

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定響應(yīng)面試驗的因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼Table1 Independent variables and their levels used in response surface analysis

2.3.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及兒茶素包封率測定結(jié)果Table2 Experimental design and corresponding values for entrapment efficiency of catechin

采用四因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面模型，試驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。該試驗共包括29個試驗點，可分為兩類：一類是析因點，自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點，共包括24個試驗點；其二是零點，為區(qū)域的中心點，零點試驗重復5次，用以估計試驗誤差。

采用Design-Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多項式回歸擬合，用以求出各影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程[23]，對影響兒茶素包封率的因素進行更深入的研究和條件優(yōu)化，并做出響應(yīng)面圖。多元回歸擬合分析得到兒茶素包封率與各因素變量的二次方程模型為：Y=23.47+1.88X1－0.22X2+0.25X3+1.21X4+0.33X1X2+1.23X1X3－0.0075X1X4－0.71X2X3－0.06X2X4－0.17X3X4－3.74X12－1.70X22－1.98X32－2.52X4。

2.3.3 回歸方程方差分析

表3 回歸模型方差分析表Table3 Analysis of variance for the developed regression equation

由表3方差分析結(jié)果可知，對兒茶素包封率建立的上述回歸模型顯著水平P＜0.000 1，表明該Quadratic回歸方程模型極顯著。方程的失擬項不顯著（P＞0.05），表明回歸方程對試驗的擬合情況較好、誤差小，能較好地描述響應(yīng)值與各影響因素之間的關(guān)系。因變量與自變量之間的相關(guān)系數(shù)R2=0.962 0，模型調(diào)整決定系數(shù)R2=0.924 0，說明該模型能解釋92.40%響應(yīng)值的變化，Adj方程擬合度較高；模型的預測系數(shù)R2pred=0.824 5，表明考察值與模型預測值之間存在高度相關(guān)性。因此，可用該回歸方程代替試驗真實點對Catechin-FA-CS納米粒的包封率進行分析和預測。對各因素回歸系數(shù)進行顯著性檢驗可知，一次項中兒茶素/FA-CS質(zhì)量比（X1）、攪拌時間（X4）以及二次項中X12、X22、X32、X42對兒茶素包封率均有極顯著的影響（P＜0.01）；交互項中兒茶素/FA-CS質(zhì)量比和pH值的交互作用對兒茶素包封率影響極顯著（P＜0.01），其他交互項影響不顯著。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，各因素對兒茶素包封率的影響大小依次為：兒茶素/FA-CS質(zhì)量比（X1）＞攪拌時間（X4）＞pH值（X3）＞FA-CS/TPP質(zhì)量比（X2）。

2.3.4 響應(yīng)面分析

圖6直觀地給出了各因素交互作用對兒茶素包封率影響的響應(yīng)面和等高線圖。從響應(yīng)面的最高點和等值線可以看出，在每個因素選取的范圍內(nèi)，存在響應(yīng)值的極值，極值出現(xiàn)在響應(yīng)面的最高處或者等值線最小橢圓的中心點[24]。

圖6 各因素交互作用對兒茶素包封率的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the interactive effects of four parameters on encapsulation efficiency of catechin

在固定其他因素的情況下，隨著所考察因素值的升高，兒茶素的包封率均上升，在響應(yīng)面的最高點（等高線的中心點）達到最大值后，包封率又呈現(xiàn)下降趨勢。其中，兒茶素/FA-CS質(zhì)量比（X1）對兒茶素的包封率影響最為顯著，表現(xiàn)為沿該因素軸向響應(yīng)面最為陡峭，等高線變化最密集，其次為攪拌時間（X4）；而沿pH值（X3）和FA-CS/TPP質(zhì)量比（X2）軸向的響應(yīng)面較平滑，等高線變化較稀疏，表明兩者對兒茶素包封率的影響較小。兒茶素/FA-CS質(zhì)量比和pH值的交互作用對兒茶素包封率的影響顯著，而其他交互項對兒茶素包封率的影響不顯著。進一步由圖6a可知，在固定反應(yīng)pH值為5.0，攪拌時間為30 min時，兒茶素/FA-CS質(zhì)量比對兒茶素包封率的影響比FA-CS/TPP質(zhì)量比影響大，表現(xiàn)為沿X1軸方向響應(yīng)面更為陡峭，等高線密集；同樣，對于兒茶素包封率的影響，兒茶素/FA-CS質(zhì)量比＞pH值（圖6b），兒茶素/FA-CS質(zhì)量比＞攪拌時間（圖6c），pH值＞FA-CS/TPP質(zhì)量比（圖6d），攪拌時間＞FA-CS/TPP質(zhì)量比（圖6e），攪拌時間＞pH值（圖6f）。

2.3.5 驗證實驗

通過回歸模型預測的最優(yōu)制備工藝為：兒茶素/FA-CS質(zhì)量比9∶20、FA-CS/TPP質(zhì)量比3.93∶1、pH 5.15、攪拌時間32.35 min。兒茶素理論包封率為23.90%，在此條件下進行3次平行實驗，Catechin-FA-CS納米粒中兒茶素的平均包封率為23.45%，實際值與理論預測值基本接近，且重復性良好，說明該數(shù)學模型能很好地預測各因素同包封率之間的關(guān)系。

2.4 Catechin-FA-CS納米粒的紅外光譜分析

圖7 Catechin-FA-CS納米粒及兒茶素的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.7 FTIR spectra of Catechin-FA-CS and catechin

由圖7可知，與FA-CS的紅外吸收峰（圖1）相比，F(xiàn)A-CS納米粒1 604.3 cm－1處的氨基面內(nèi)變形振動吸收偏移至1 606.9 cm－1處，并在1 537.4 cm－1處產(chǎn)生了新的吸收峰，這表明FA-CS的氨基與TPP陰離子發(fā)生了交聯(lián)[25]。兒茶素3 316.1 cm－1和1 608.1 cm－1處為O—H和C＝C鍵的伸縮振動，在FA-CS納米粒中相應(yīng)峰有一定增強。3 250 cm－1處的振動吸收峰變寬可能是由于交聯(lián)作用，分子內(nèi)和分子間氫鍵作用增強而導致的寬化，這些結(jié)果表明兒茶素已包埋至FA-CS納米粒中。

2.5 Catechin-FA-CS納米粒的透射電鏡分析

圖8 Catechin-FA-CS納米粒的透射電鏡圖Fig.8 Transmission electron micrograph of Catechin-FA-CS particles

為進一步驗證兒茶素在FA-CS顆粒中的包埋情況，科研人員將Catechin-FA-CS納米粒置于透射電子顯微鏡下進行觀察，結(jié)果見圖8。采用分子自組裝原理制備的Catechin-FA-CS納米粒形態(tài)均勻，外形較圓整，接近于規(guī)則的球形，基本無團聚現(xiàn)象，顆粒之間稍有黏連可能是由于制樣分散不均造成。同時，電鏡結(jié)果也表明Catechin-FA-CS納米粒的粒徑分布在200～500 nm范圍內(nèi)。

3 結(jié) 論

采用分子自組裝原理制備載兒茶素葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒，通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗，以兒茶素包封率為考察指標，進行工藝優(yōu)化，得到的最佳制備工藝條件為：兒茶素/FA-CS質(zhì)量比9∶20、FA-CS/TPP質(zhì)量比3.93∶1、pH 5.15、攪拌時間32.35 min。在此條件下，兒茶素包封率為23.45%，與理論值23.90%接近。紅外光譜分析證實兒茶素已包埋進納米粒中，透射電鏡分析表明所制粒子大小較均勻，接近于規(guī)則球形，分布在200～500 nm范圍內(nèi)。利用響應(yīng)面法優(yōu)化載兒茶素葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒的制備工藝是可行的。

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