張艷霞 閻瀾 姜遠(yuǎn)英

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350108;2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

近幾年，我國深部真菌感染發(fā)病率不斷升高，其中白念珠菌引起的感染約占60.7%［1］。白念珠菌是引起皮膚黏膜和系統(tǒng)性真菌感染的常見病原菌。臨床缺乏早期念珠菌診療手段、可用抗真菌藥物種類有限、抗菌譜窄且毒副作用大及耐藥性等問題是臨床真菌感染難以治療的主要原因。免疫缺陷患者侵襲性念珠菌感染的死亡率由30%增加到50%［2］。疫苗毒副作用低，具有靶向選擇性，因而，開發(fā)具有強(qiáng)化機(jī)體免疫功能和抗真菌作用的疫苗成為防治白念珠菌感染的有效措施?？拐婢呙缂せ畲傺准?xì)胞因子Th1或者Th17，并表達(dá)共刺激分子，從而指導(dǎo)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的應(yīng)答，最終吞噬細(xì)胞能夠清除真菌細(xì)胞，抑制真菌感染;理想抗原能刺激宿主B細(xì)胞產(chǎn)生足夠水平的特異性保護(hù)性抗體。白念珠菌的毒力因子、葡聚糖、甘露糖、熱休克蛋白90(Hsp90)、幾丁質(zhì) (chitin)和烯醇化酶(enolase)等都被用作抗原，可刺激宿主產(chǎn)生保護(hù)性抗體，故可作為疫苗研發(fā)。以下就目前白念珠菌的疫苗和抗體研究進(jìn)展作一綜述。

1 糖及糖蛋白疫苗

白念珠菌和其他真菌的候選疫苗大多含有糖類成分，如β-葡聚糖、甘露糖。而這些糖類成分先通過結(jié)合固有免疫細(xì)胞表面受體，激活固有性免疫細(xì)胞，再進(jìn)一步誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫的發(fā)生。

β-葡聚糖，是白念珠菌細(xì)胞壁中含量最高的多糖。Bromuro等［3］用熱滅活白念珠菌和釀酒酵母免疫小鼠，小鼠免疫血清中存在與β-1，3和β-1，6葡聚糖 (GG)反應(yīng)的抗體。因此 Torosantucci等［4-5］認(rèn)為葡聚糖組成的疫苗可能更符合臨床的需要。為了驗(yàn)證這一設(shè)想，他們使用了一種與病原真菌無關(guān)的昆布多糖，來源于棕色海藻，有β-葡聚糖的特性，可替代真菌成為免疫原。但是由于昆布多糖本身免疫原性較弱，Torosantucci將蛋白疫苗白喉毒素CRM197與之結(jié)合，制備成糖-蛋白結(jié)合性疫苗(Lam-CRM)。用Lam-CRM免疫小鼠，結(jié)果表明該疫苗對系統(tǒng)性念珠菌感染有很好的免疫保護(hù)作用，小鼠存活率在70%以上，感染后腎臟中菌落的富集量顯著減少。小鼠血清中產(chǎn)生了抗β-葡聚糖的IgM和IgG型抗體。將此疫苗接種大鼠陰道內(nèi)，能顯著減少陰道內(nèi)白念珠菌 CFU計(jì)數(shù)［6-7］。Bromuro等［8］使用油水兼容性佐劑 MF59與Lam-CRM疫苗共同接種小鼠陰道，結(jié)果表明該免疫能顯著保護(hù)小鼠陰道，防治真菌感染。β-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁必不可少的成分，Rachini等［9-10］于2007年研究結(jié)果表明:β-葡聚糖也是抗新生隱球菌和卡氏肺囊蟲保護(hù)性抗體的作用靶點(diǎn)。此疫苗同時(shí)對曲霉也有免疫作用，推測可能對所有細(xì)胞壁中含有葡聚糖的真菌都有效。因此，Lam-CRM這種糖-蛋白結(jié)合疫苗是一種與病原體種類無關(guān)的、較有前景的新型疫苗。

甘露糖，是白念珠菌細(xì)胞壁的重要組成成分。甘露聚糖與蛋白質(zhì)或脂類共價(jià)結(jié)合，存在于胞壁最外層，由β-1，2連接的甘露糖殘基構(gòu)成的多糖部分與磷脂連接形成磷酸甘露聚糖。在系統(tǒng)性白念珠菌感染過程中，細(xì)胞壁表面成分最先與宿主接觸，能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫防御反應(yīng)，其中磷酸甘露糖復(fù)合物 (phosphate mannose compound，PMC)是導(dǎo)致該效應(yīng)的最主要成分之一。但是，PMC被單獨(dú)作為念珠菌疫苗時(shí)，機(jī)體的敏感性很低［11］。Polonelli等［12］將脂質(zhì)體用作PMC的佐劑載體并在系統(tǒng)性念珠菌模型中實(shí)驗(yàn)，用脂質(zhì)體包埋的PMC接種到小鼠體內(nèi)，被接種的小鼠比對照組小鼠生存時(shí)間延長。但脂質(zhì)體的不穩(wěn)定性和多重體內(nèi)注射的必須性阻礙了這種疫苗的臨床應(yīng)用。Han Y等［13］用人工合成的β-1，2-甘露三醇取代 PMC，并以體內(nèi)表達(dá)白念珠菌細(xì)胞壁表面蛋白代替小牛血清載體蛋白，這種包括了確定的甘露聚糖表位和體內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞外載體蛋白的疫苗有潛力誘導(dǎo)一個更強(qiáng)的保護(hù)反應(yīng)，因此提高了疫苗預(yù)防念珠菌的潛在效能。

甘露糖蛋白(MP)是白念珠菌細(xì)胞壁糖蛋白，是一種重要毒性因子?？筂P單克隆抗體MAbC7和MAbK10具有對抗白念珠菌的作用，可抑制真菌與喉癌上皮細(xì)胞的黏附，抑制真菌菌絲生長。Sevilla等［14］2006年的研究表明，MAbC7單獨(dú)使用可以保護(hù)小鼠抵抗系統(tǒng)性念珠菌病。但是MAbC7具體針對的細(xì)胞表位目前為止并不明確，推測可能被細(xì)胞壁糖基所覆蓋。Omaetxebarrfa等［15］認(rèn)為，白念珠菌表面的烯醇化酶以及核孔蛋白Nup88可能是其識別表位。2011年 Xin H.和 Bren S.等［16-17］的研究已證實(shí)MAbC7具有抗念珠菌活性，阻斷真菌細(xì)胞壁黏附素的表達(dá)，抑制白念珠菌黏附于宿主細(xì)胞壁，抑制出芽，具有強(qiáng)大的廣譜殺菌作用。

2 核糖體疫苗

對于亞單位疫苗的研究，Segal等從1981～1997年對白念珠菌核糖體片段研究最廣泛［18-20］。他們通過對白念珠菌胞質(zhì)的差速離心獲得一系列核糖體片段，將其與弗氏不完全佐劑(IFA)作為免疫原，分別免疫3組具有不同免疫力的小鼠:正常免疫功能ICR小鼠組，環(huán)磷酰胺預(yù)處理過的免疫功能低下小鼠組，Balb/c與C57小鼠雜交有淋巴腫瘤的F1小鼠組，用致死劑量的白念珠菌攻擊各組接種疫苗的小鼠，結(jié)果顯示白念珠菌核糖體片段免疫小鼠能有效控制正常小鼠白念珠菌的感染，對于免疫缺陷小鼠有部分保護(hù)作用，即使對有淋巴腫瘤的F1小鼠也有一定的保護(hù)性。他的研究提示白念珠菌核糖體片段，對熱帶念珠菌也有免疫防治作用［19］。因以IFA為佐劑的核糖體疫苗臨床效果不佳，Levy等1989年報(bào)道［21］應(yīng)用白念珠菌核糖體片段與肺炎克雷伯菌細(xì)胞壁片段的組合疫苗可增強(qiáng)療效。肺炎克雷伯菌細(xì)胞壁片段發(fā)揮佐劑的作用，這為白念珠菌核糖體疫苗成為臨床候選疫苗開辟了道路。Segal的團(tuán)隊(duì)在1997年報(bào)道的研究中用脂質(zhì)體作為佐劑［20］，使用了兩種制備技術(shù)把核糖體包埋入脂質(zhì)體中，脂質(zhì)體不僅充當(dāng)疫苗的載體，同時(shí)也作為一種免疫佐劑。他們發(fā)現(xiàn)這種疫苗與普通核糖體疫苗同樣具有顯著保護(hù)效果，而且以脂質(zhì)體為載體的疫苗可同時(shí)誘發(fā)細(xì)胞和體液免疫。但是核糖體提取物的成分中可能包含mRNA、多肽、殘留胞壁、rRNA和核糖體蛋白等，所以核糖體疫苗的免疫原性并不是十分清楚，但Segal等的研究還是顯示了這類疫苗潛在的利用價(jià)值。

3 Hsp90蛋白疫苗及抗體

白念珠菌熱休克蛋白(heat shock proteins)，是能使白念珠菌適應(yīng)不利的生存環(huán)境的一類蛋白。Hsp90是存在于白念珠菌細(xì)胞壁與胞質(zhì)的蛋白質(zhì)，是很多分子量在90kD附近的熱休克蛋白。熱休克蛋白作為分子伴侶，可以協(xié)助其他蛋白分子折疊，防止蛋白聚集，促進(jìn)折疊錯誤的蛋白定向降解。Hsp90廣泛表達(dá)，并高度保守，占細(xì)胞內(nèi)總蛋白的1% ～2%［22］。

Fukuizumi等［23］從系統(tǒng)性念珠菌感染的患者血清中分離獲得Hsp90(相對分子質(zhì)量90 kD)和它的降解片段 (相對分子質(zhì)量47 kD)。經(jīng)檢測，92%系統(tǒng)性白念珠菌感染患者和恢復(fù)患者均產(chǎn)生了高滴度的針對47 kD分子的抗體。Matthews等［24］對此進(jìn)一步研究，用系統(tǒng)性念珠菌感染患者血清找出Hsp90 C末端的連續(xù)表位C、B和H，表位C，即LKVIRK表位，免疫印跡上與47 kD反應(yīng)的患者血清均識別表位C。以化學(xué)合成的LKVIRK表位與匙孔藍(lán)蛋白偶聯(lián)物作為免疫原，再用免疫動物獲得的抗Hsp90抗體對感染小鼠進(jìn)行免疫治療，結(jié)果表明抗Hsp90抗體治療能明顯降低系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠的死亡率。Matthews等進(jìn)一步證明:重組rHsp90蛋白疫苗能夠誘導(dǎo)感染系統(tǒng)性念珠菌病的實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生高水平抗Hsp90的特異性抗體。Wang等［25］研究發(fā)現(xiàn):針對白念珠菌熱休克蛋白Hsp90的特殊表位(SE-CA-HSP90)產(chǎn)生的特異性抗體，能夠增強(qiáng)遲發(fā)性超敏反應(yīng)、自然殺傷細(xì)胞的活性和ConA介導(dǎo)的脾細(xì)胞增值，白念珠菌Hsp90的特殊表位(SE-CA-HSP90)可能會成為一個具有潛力的抵抗白念珠菌感染的疫苗?？拱啄钪榫鸁嵝菘说鞍?0抗體依芬古單抗(efungumab)是人的重組抗Hsp90的單克隆抗體片段，模擬Hsp90抗體的保護(hù)作用，其在與兩性霉素B脂質(zhì)體開展的隨機(jī)雙盲臨床研究中，顯示出不錯的治療效果;同時(shí)依芬古單抗還可協(xié)同其他抗真菌藥物如卡泊芬凈等，用于治療侵襲性念珠菌?。?6］。

4 凝集素家族蛋白疫苗

黏附素是白念珠菌的毒力因子之一，能促進(jìn)菌體對宿主細(xì)胞的黏附。凝集素樣 (agglutinin-like sequence，ALS)蛋白家族，是白念珠菌發(fā)揮黏附功能的主要蛋白。Als1p(Agglutinin-like sequence 1 protein)屬于白念珠菌外源凝集素超家族成員之一，可介導(dǎo)白念珠菌與人體細(xì)胞相結(jié)合［27］。Spellberg［28］和 Ibrahim 等［29］利用重組 Als1p 氨基端多肽(rAlslp-N)疫苗及重組Als3p(Agglutinin-like sequence 3 protein)氨基端多肽(rAls3p-N)疫苗聯(lián)合佐劑接種小鼠，對血液播散性念珠菌感染小鼠都有免疫保護(hù)作用，且效果相當(dāng)。但是rAls3p-N對口腔和陰道黏膜局部的念珠菌病防治效果比rAlslp-N更好。rAls1p-N及rAls3p-N均可通過遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)發(fā)揮免疫保護(hù)效應(yīng)［30］，兩者皆有望成為防治播散性和局部念珠菌病的候選蛋白疫苗。

5 活菌疫苗

滅活的全疫苗能使機(jī)體產(chǎn)生特異性的細(xì)胞和體液免疫，由此人們采用了不同方法制備滅活的菌體疫苗。Fukuizumi等［23］將經(jīng)福爾馬林處理過的滅活白念珠菌接種在家兔扁桃體上，誘導(dǎo)產(chǎn)生了抑制白念珠菌與人口腔上皮細(xì)胞黏附的抗體，這為全細(xì)胞滅活疫苗預(yù)防并治療口腔念珠菌病提供可能。Bromuro等［3］用二硫蘇糖醇和蛋白酶K處理熱滅活的酵母態(tài)白念珠菌，他們將處理及未處理的滅活細(xì)胞分別對感染小鼠進(jìn)行尾靜脈注射，發(fā)現(xiàn)注射處理后滅活細(xì)胞的小鼠平均存活時(shí)間達(dá)60 d以上，而注射普通滅活細(xì)胞的小鼠平均存活時(shí)間為1～3 d。Bromuro等研究中還發(fā)現(xiàn)一些抗念珠菌表面抗原的抗體可以阻斷免疫血清的自衛(wèi)能力。所以通過處理去除了細(xì)胞表面抗原的滅活細(xì)胞疫苗，免疫效果更佳。

目前還有一些減毒的活菌疫苗正被研究。Fernandez等［31］將絲裂原活化蛋白激酶相關(guān)基因HOG1敲除的白念珠菌CNC13用于免疫白念珠菌系統(tǒng)性感染小鼠模型，小鼠存活率達(dá)60%～70%。Martínez 等［32］用白念珠菌 ECM33(編碼白念珠菌細(xì)胞壁合成成分)突變株、Saville等［33］用白念珠菌tet-NRG1(參與調(diào)節(jié)白念珠菌菌絲的生長)突變株作為疫苗，也得到了顯著的抗白念珠菌感染的效果。

6 P43疫苗及抗體

白念珠菌P43(促B細(xì)胞分裂素)是白念珠菌抵抗宿主防御反應(yīng)所必需的一種蛋白，該蛋白可以通過與單核/吞噬細(xì)胞的相互作用，使白介素10水平升高，從而抑制淋巴細(xì)胞清除病原體的能力。Tavares等［34］進(jìn)行了P43中和抗體消除實(shí)驗(yàn)。他們將P43皮下注射小鼠，并在3周后給與免疫加強(qiáng)劑;免疫接種P43后予以腹腔注射白念珠菌，在接種后第7天和15天被念珠菌感染小鼠組中沒有發(fā)現(xiàn)菌落富集現(xiàn)象，在接種后30 d被感染的小鼠組內(nèi)，25只中只有1只小鼠有真菌存在;而對照組中，白念珠菌菌落富集現(xiàn)象嚴(yán)重。Tavares等［34］進(jìn)一步研究用非致死劑量的白念珠菌接種于小鼠體內(nèi)，30 d后，用致死劑量的白念珠菌攻擊，進(jìn)而將抗P43的抗體 (用非致死劑量的白念珠菌芽孢免疫過30 d后，小鼠血清中提取所得)注射給小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)白念珠菌菌落富集量明顯下降。對于該種疫苗目前還在進(jìn)一步的研究中。

7 Sap2疫苗及抗體

分泌型天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartie proteinase，SAP)是白念珠菌的一種胞外水解酶，被認(rèn)為是白念珠菌致病機(jī)制中重要的毒力因子之一。De Bernardis等［35］研究認(rèn)為使用SAP蛋白免疫小鼠可以產(chǎn)生抗SAP抗體，該抗體可保護(hù)陰道不受念珠菌的感染。在天冬氨酰蛋白酶家族 (Saps)中，Sap2主要與黏膜感染有關(guān)，并且在感染后期優(yōu)先表達(dá)。Vilanova等［36］利用Sap2作為抗原進(jìn)行預(yù)防接種，發(fā)現(xiàn)皮內(nèi)注射高度純化的以明礬為佐劑的天然Sap2蛋白有明顯的免疫保護(hù)作用。并且可以降低白念珠菌感染小鼠腎臟的菌負(fù)荷。Sandini等［37］用重組Sap2的氨基端多肽 (rSap2t)，以霍亂毒素為佐劑免疫大鼠，再用免疫獲得的抗rSap2t抗體去免疫陰道感染模型的幼型大鼠，能明顯降低實(shí)驗(yàn)組大鼠陰道分泌物的載菌量。

8 抗白念珠菌卵黃蛋白抗體

抗白念珠菌卵黃抗體是白念珠菌免疫產(chǎn)蛋母雞后從雞蛋中提取的一種卵黃免疫球蛋白(IgY)，它能與白念珠菌特異性結(jié)合。Ibrahim等［38］使用免疫抑制的小鼠模型研究抗白念珠菌卵黃蛋白抗體在體內(nèi)的作用，發(fā)現(xiàn)口腔給藥可明顯降低小鼠口腔白念珠菌的數(shù)量。Wang等［39］體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抗白念珠菌卵黃蛋白抗體還可以抑制氟康唑耐藥或是敏感白念珠菌的生長。這些結(jié)果說明抗白念珠菌卵黃蛋白抗體在體內(nèi)或體外均可抑制白念珠菌的黏附和生長，能有效對抗口腔念珠菌病，并可減少白念珠菌的播散。Fujibayashi等［40］研究發(fā)現(xiàn)卵黃蛋白抗體對白念珠菌黏附及生物被膜的生長有明顯抑制作用，還可以減少白念珠菌對人口腔上皮細(xì)胞的黏附且存在劑量依賴性。雞卵黃抗體以其制備簡便、產(chǎn)量高、成本低、安全性好等優(yōu)勢，有望能較好地應(yīng)用于防治口腔白念珠菌感染。

9 結(jié) 語

迄今為止，只有極少數(shù)白念珠菌抗原被生產(chǎn)出來，它們中只有極少數(shù)在實(shí)驗(yàn)動物模型中被徹底研究過免疫原性和保護(hù)性。不同的白念珠菌菌株毒力各不相同。因此，抗白念珠菌的候選疫苗必須考慮到白念珠菌菌株多樣性，需要對不同的白念珠菌都能起效。白念珠菌疫苗對于白念珠菌病的預(yù)防和治療都有積極意義。預(yù)防性疫苗能有效控制白念珠菌的傳播，而治療性疫苗將會降低白念珠菌感染的死亡率。目前認(rèn)為治療白念珠菌感染除了抗真菌藥物以外，還需使機(jī)體處于高免疫狀態(tài)。由此，抗白念珠菌感染疫苗的研制顯得格外重要，特別是對那些因?yàn)榭拐婢幬锒鴮?dǎo)致體內(nèi)正常菌群失調(diào)的患者更是如此。前期一些成功的實(shí)驗(yàn)以及新的基因工程疫苗、免疫佐劑、細(xì)胞因子和給予免疫激活樹突狀細(xì)胞等免疫療法的出現(xiàn)，將為疫苗的進(jìn)一步研究，提供更多可能。

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