石莉娜 劉曉峰

(1.云南昆明長(zhǎng)水國際機(jī)場(chǎng)醫(yī)療急救中心，昆明 650500;2.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500)

自然界中的微生物分布廣、種類多、資源極其豐富，主要包括細(xì)菌、病毒、真菌等。迄今人們已發(fā)現(xiàn)的微生物物種僅為自然界中微生物總數(shù)的1%～10%［1］。微生物群落多樣性是環(huán)境微生物多樣性研究的核心內(nèi)容。目前微生物多樣性研究多局限于細(xì)菌，而對(duì)真菌的研究相對(duì)較少。研究真菌群落多樣性可以了解真菌群落結(jié)構(gòu)、真菌的種類和數(shù)量分布特點(diǎn)，并且可以進(jìn)一步為控制和優(yōu)化真菌群落結(jié)構(gòu)提供參考，同時(shí)也是研究微生物群落多樣性的重要內(nèi)容。真菌遍布于自然界，據(jù)估計(jì)約有數(shù)百萬種，已發(fā)現(xiàn)的僅9萬余種，已發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致人類疾病的僅約400種［2］。人類也生活在真菌包圍的環(huán)境中，日常工作、生活中所接觸到的真菌種類遠(yuǎn)超目前的認(rèn)知。因此，不論是自然環(huán)境還是人體都具有較高的真菌多樣性。

真菌多樣性的研究方法很多，從國內(nèi)外目前采用的方法來看，大致上可分為:傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法、分子生物學(xué)方法以及宏基因組學(xué)技術(shù)。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新技術(shù)、新方法用于真菌多樣性領(lǐng)域的研究，使人們對(duì)真菌多樣性的認(rèn)識(shí)更加全面深入。

1 傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法

從傳統(tǒng)上講，真菌多樣性的研究主要利用分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)檢測(cè)的方法，該技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室被廣泛使用。盡管各種新的培養(yǎng)技術(shù)不斷出現(xiàn)，但此方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，敏感度和特異性也較低，也不能反應(yīng)全部的真菌群落信息［3-4］。Amann 等［5］曾根據(jù)微生物原位的、不依賴于培養(yǎng)的微生物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究結(jié)果認(rèn)為:在自然界中，通過實(shí)驗(yàn)室人工培養(yǎng)方法已經(jīng)被分離和描述的微生物物種數(shù)量?jī)H占估計(jì)數(shù)量的1% ～5%，而其余大多數(shù)微生物種群還仍然未被分離和認(rèn)識(shí)，因此，人們不能利用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)獲得真菌多樣性的全部信息，極大的限制了研究的廣泛性。在臨床致病菌的鑒定方面，培養(yǎng)的方法更為常用。Rasi等［6］利用培養(yǎng)法對(duì)從伊朗花斑糠疹患者皮膚上分離得到的馬拉色酵母菌進(jìn)行鑒定過程中，發(fā)現(xiàn)球形馬拉色菌是最常分離到的菌種，大約占31.3%，其次是糠秕馬拉色菌(20.5%)等。Findley等［7］通過微生物培養(yǎng)法從10個(gè)健康成人的14個(gè)部位的皮膚分離真菌，經(jīng)鑒定11個(gè)剛體部位和胳膊表面的優(yōu)勢(shì)真菌是馬拉色菌屬，通過比較，腳底、腳趾甲和趾間具有較高的真菌多樣性。

2 分子生物學(xué)方法

鑒于分離培養(yǎng)技術(shù)的局限性，近年來，利用不依賴培養(yǎng)的方法分析和鑒定微生物群落多樣性的實(shí)驗(yàn)越來越普遍。自從Pace［8］提出將分子生物學(xué)方法用于微生物多樣性研究，微生物分子生態(tài)學(xué)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析使得對(duì)環(huán)境樣品中占大部分的不可培養(yǎng)微生物的研究成為了可能。目前，大多數(shù)用于分析微生物群落結(jié)構(gòu)的方法是基于PCR擴(kuò)增的。在分析微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性時(shí)，rRNA是目前應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記，它具有在功能上高度保守，其序列上的不同位置具有不同的變異速率，存在于所有的有機(jī)體(病毒除外)內(nèi)等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于細(xì)菌而言，16S rRNA分析在實(shí)際應(yīng)用中最為廣泛，與細(xì)菌相比，使用真菌18S rDNA只能鑒定到屬或科的水平。真菌的非編碼rRNA區(qū)域，如ITS區(qū)域 (Internal transcribed spacer)，進(jìn)化快速，序列上的變化更加廣泛，因此提供了更多的分類信息，彌補(bǔ)了18S rRNA的局限性。雖然如此，在實(shí)際研究?jī)?nèi)容中仍然要根據(jù)對(duì)分類等級(jí)的不同要求來選擇合適的分子標(biāo)記。

分子生物學(xué)方法的應(yīng)用使在遺傳水平上研究微生物多樣性成為了可能，該方法可歸納為三方面:①基于PCR技術(shù)的研究方法，這些方法是對(duì)樣品直接提取DNA或者RNA，然后對(duì)特定基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再利用不同的方法進(jìn)行分析，如變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)、構(gòu)建克隆文庫、末端限制性長(zhǎng)度多態(tài)性(Terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)等。②基于分子雜交技術(shù)的分子標(biāo)記法，如熒光原位雜交 (Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)，可以對(duì)微生物在特定環(huán)境中的存在與否、分布模式及豐度等情況進(jìn)行研究，具有較高的靈敏性和特異性。③基于DNA序列測(cè)定的研究方法，分析具體堿基序列的分布情況，通過與生物信息學(xué)結(jié)合，進(jìn)行數(shù)據(jù)比較分析，如元基因組(Metagenome)測(cè)序技術(shù)，成為研究難培養(yǎng)微生物或不可培養(yǎng)微生物多樣性的重要方法［9］。

2.1 基于PCR的克隆文庫方法

基于PCR的克隆文庫方法使對(duì)不可培養(yǎng)微生物的分析成為可能，Pace［10］提出將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆后測(cè)序，大大提高了對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)，是使用較為廣泛的一種方法。目前已有研究采用針對(duì)18S rDNA及ITS的克隆文庫構(gòu)建技術(shù)對(duì)腸道內(nèi)真菌群落的多樣性進(jìn)行分析，研究結(jié)果表明人腸道真菌多樣性比較低，主要以不同亞型的芽囊原蟲屬為主［11］。

2.2 變性梯度凝膠電泳 (DGGE)

DGGE最初是lerman等［12-13］發(fā)明的，起初主要用來檢測(cè)DNA片段中的點(diǎn)突變。1993年，Muyzer等［14］首次將其用于微生物群落多樣性的研究。DGGE普遍用于分析環(huán)境中細(xì)菌、真菌、病毒群落的生物多樣性。Kim等［15］利用PCR-DGGE技術(shù)分析了日本和中國發(fā)酵豆瓣醬中的細(xì)菌和真菌群落多樣性，確定了米曲霉和魯氏酵母的存在。Weerasekera等［16］通過PCR-DGGE方法研究人唾液中的酵母菌，在其中六個(gè)樣品中鑒定出兩種酵母菌，分別是白色念珠菌和杜氏假絲酵母，有力的證明利用DGGE技術(shù)研究口腔中的酵母菌是一種相對(duì)快速便捷的方法。

2.3 末端限制性長(zhǎng)度多態(tài)性 (T-RFLP)

T-RFLP技術(shù)是在末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，依據(jù)rDNA序列的保守性和特異性，選擇具有系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記特征的序列作為目的序列。T-RFLP技術(shù)靈敏度高，對(duì)于評(píng)估復(fù)雜環(huán)境樣品的多樣性和快速的比較不同生態(tài)系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性是一種有力的工具。Curlevski等［17］使用T-RFLP方法研究了澳大利亞商業(yè)化混交林和單一種植南洋杉林場(chǎng)土壤真菌群落的不同，通過對(duì)真菌的ITS區(qū)域進(jìn)行分析表明子囊菌門的豐度最高，其次是擔(dān)子菌門和接合菌門，但在不同類型的林場(chǎng)中它們的相對(duì)豐度存在差異。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)

qPCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，是將熒光能量傳遞技術(shù) (Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)應(yīng)用于 PCR，實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。qPCR技術(shù)目前已得到廣泛應(yīng)用。李曉然等［18-19］在對(duì)汾酒發(fā)酵過程和汾酒酒曲制作過程中細(xì)菌和真菌多樣性的研究中，利用qPCR技術(shù)對(duì)整個(gè)過程中的細(xì)菌和真菌進(jìn)行了定量，發(fā)現(xiàn)在汾酒發(fā)酵過程中真菌的數(shù)量保持相對(duì)穩(wěn)定，在酒曲制作過程中真菌的數(shù)量整體上呈下降趨勢(shì)。Li等［20］通過qPCR方法研究了老年人舌背的真菌多樣性，表明老年人口腔中的真菌多樣性極高，并不僅限于念珠菌屬，其多樣性與老年人的健康狀態(tài)也具有密切的關(guān)系。

2.5 熒光原位雜交 (FISH)

比起費(fèi)時(shí)費(fèi)力且難以展現(xiàn)全部微生物群落信息的依賴于培養(yǎng)的方法和難以實(shí)現(xiàn)定量分析的多種依賴于PCR擴(kuò)增的分子生物學(xué)方法，使用探針雜交來研究微生物群落多樣性是一種更為快速的方法。熒光原位雜交是以熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針來探測(cè)生態(tài)系統(tǒng)中微生物細(xì)胞的一種技術(shù)，不僅能研究自然或人工環(huán)境中的微生物個(gè)體，并且可以對(duì)微生物群落進(jìn)行評(píng)估。Lepère等［21］使用酪胺信號(hào)放大技術(shù)與FISH結(jié)合的方法，用18S rDNA特異性的引物分析了湖水中的真核超微浮游生物的主要類群，獲得了真核浮游微生物的定量結(jié)果。

雖然分子生物學(xué)方法目前是闡述微生物多樣性的強(qiáng)有力技術(shù)手段，并且在真菌多樣性研究中具有傳統(tǒng)培養(yǎng)法無法比擬的優(yōu)勢(shì)，但是基于PCR擴(kuò)增的各種方法及FISH等方法仍然存在著多種弊端，例如引物的偏向性、PCR存在的其他系統(tǒng)偏差以及FISH方法中由于引物的不匹配造成對(duì)分析結(jié)果的錯(cuò)誤估計(jì)等。在實(shí)際的研究中，通常將多種技術(shù)綜合使用，以避免由于方法原理本身所帶來的不可避免的偏差，可提供更加全面準(zhǔn)確的微生物多樣性變化的信息［22-24］。

2.6 序列標(biāo)簽標(biāo)記的高通量測(cè)序

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，被稱為“第二代測(cè)序(next-generation sequencing［NGS］)”技術(shù)在過去幾年中不斷涌現(xiàn)。其特點(diǎn)是:高通量，低成本，可以同時(shí)對(duì)多個(gè)單獨(dú)的DNA分子進(jìn)行測(cè)序，這一改進(jìn)比起每條序列需要單獨(dú)分析的Sanger法具有巨大的優(yōu)勢(shì)。第二代測(cè)序技術(shù)主要包括羅氏454公司的GS-FLX測(cè)序平臺(tái)、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測(cè)序平臺(tái)和 ABI公司的 Solid測(cè)序平臺(tái)［25］。自從 Hamady 等［26］建立了在不同的樣品PCR引物上分別添加序列標(biāo)簽 (barcode)來作為高通量測(cè)序后根據(jù)序列區(qū)分不同樣品的標(biāo)記，高通量測(cè)序技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用到微生物群落多樣性的分析中。綜合比較二代測(cè)序平臺(tái)，在研究微生物多樣性方面應(yīng)用較廣泛的是焦磷酸測(cè)序 (Pyrosequencing)。李曉然等［18］利用真菌 ITS1的焦磷酸測(cè)序，研究了中國傳統(tǒng)汾酒發(fā)酵過程中的真菌群落多樣性，分析了在汾酒發(fā)酵過程中真菌的變化以及主要存在的真菌菌種，其中有60%的ITS序列屬于酵母菌科，豐度最高的是東方伊薩酵母，其次為啤酒酵母。Delhaes等［27］利用焦磷酸測(cè)序的方法對(duì)囊泡纖維癥患者的真菌多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明肺功能下降及臨床狀態(tài)不好的患者真菌多樣性明顯降低。Hoffmann等［28］對(duì)人體腸道的真菌多樣性進(jìn)行研究，通過焦磷酸測(cè)序表明人腸道中的真菌共66個(gè)屬，豐度較高的是子囊菌綱和擔(dān)子菌類。

3 宏基因組學(xué)技術(shù)(Metagenomics)

利用基于rDNA的分子生物學(xué)方法研究微生物多樣性，對(duì)于龐大的微生物世界仍然是不足夠的，遠(yuǎn)不能闡明微生物的生理生化代謝特征。1998年，Handelman等［29］首次提出宏基因組的概念，并第1次使用了Metagenomics這個(gè)詞。宏基因組學(xué)技術(shù)是通過提取某一環(huán)境樣品所有微生物的基因組DNA，或通過鳥槍法直接測(cè)序探究環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能，或構(gòu)建宏基因組文庫及對(duì)文庫進(jìn)行篩選尋找和發(fā)現(xiàn)新的功能基因及活性代謝產(chǎn)物。通過這兩方面的研究，極大地豐富了我們對(duì)環(huán)境樣品微生物多樣性和其功能的認(rèn)知。

宏基因組學(xué)技術(shù)避開傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法，直接從樣品中提取總DNA來展開研究，理論上覆蓋了環(huán)境樣品中的全部微生物，在分析環(huán)境微生物復(fù)雜群落結(jié)構(gòu)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。該技術(shù)在微生物多樣性領(lǐng)域的研究，有關(guān)細(xì)菌方面［30-31］的居多，而關(guān)于真菌群落多樣性的研究為數(shù)并不多。Illeghems等［32］利用宏基因組學(xué)技術(shù)研究了可可豆自然發(fā)酵過程中的真菌和細(xì)菌群落多樣性，研究結(jié)果表明，葡萄汁有孢漢遜酵母、仙人掌有孢漢遜酵母、啤酒酵母、發(fā)酵乳桿菌和巴氏醋桿菌是主要存在的菌種，并且確定了主要以乳桿菌為宿主的肌病毒科和長(zhǎng)尾噬菌體的存在。這是第1篇利用宏基因組學(xué)技術(shù)并結(jié)合454焦磷酸測(cè)序研究自然發(fā)酵可可豆中群落多樣性種系發(fā)生分析的報(bào)道，顯示了宏基因組學(xué)技術(shù)相比于之前研究方法的優(yōu)越性，能夠獲得更加全面的微生物群落信息。宏基因組學(xué)技術(shù)不僅在研究微生物群落結(jié)構(gòu)方面蘊(yùn)含巨大潛力，在發(fā)現(xiàn)新功能基因及活性物質(zhì)方面也具有極大的優(yōu)勢(shì)。Cardoso等［33］在對(duì)被蝸牛侵襲的農(nóng)作物進(jìn)行宏基因組學(xué)分析中，第1次對(duì)其微生物群落和參與生物化學(xué)通路的主要基因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)變形菌門是主要的細(xì)菌門，其次是擬桿菌門和硬壁菌門，而病毒、真菌及古細(xì)菌的多樣性稍低。另外，通過功能分析發(fā)現(xiàn)其中存在的大量微生物基因有助于宿主降解木質(zhì)纖維素、對(duì)異生物質(zhì)脫毒以及合成必需氨基酸和維生素，同時(shí)有利于蝸牛的適應(yīng)性和廣泛攝食，并且檢測(cè)到2 700多種編碼糖苷水解酶區(qū)域和碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因。通過宏基因組學(xué)技術(shù)不僅能夠避免PCR擴(kuò)增帶來的偏差，全面而準(zhǔn)確的研究微生物群落多樣性，同時(shí)也為研究樣品中微生物生化代謝、發(fā)現(xiàn)新功能基因和活性物質(zhì)提供了極大的便利。

宏基因組學(xué)技術(shù)在分析群落多樣性中不可避免地也會(huì)存在一些弊端，例如測(cè)序產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)為后續(xù)的序列分析和處理帶來了挑戰(zhàn)，同時(shí)對(duì)計(jì)算機(jī)以及數(shù)據(jù)庫的要求也在不斷提高。盡管如此，宏基因組學(xué)技術(shù)本身所具有的巨大優(yōu)勢(shì)是目前其他研究方法不可比擬的。近年來，宏基因組學(xué)技術(shù)已經(jīng)開始影響真菌生物學(xué)，逐漸成為研究真菌多樣性的一個(gè)新的發(fā)展方向和研究熱點(diǎn)，也增加了獲得新生物活性物質(zhì)的機(jī)會(huì)，顯示宏基因組學(xué)技術(shù)在此方面蘊(yùn)含的巨大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

4 前景與展望

近年來，隨著各種新技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，對(duì)真菌多樣性的研究逐漸深入，利用這些新技術(shù)可以從不同的角度來研究真菌多樣性，為環(huán)境微生物多樣性和人體真菌病的診斷治療奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。值得一提的是，為了獲得更為全面的真菌多樣性信息，在條件許可的情況下可將幾種方法結(jié)合起來使用。目前對(duì)于真菌多樣性的研究是多方面的，不論是環(huán)境中、食品中還是定植于人體各部位的真菌，通過對(duì)其多樣性的研究必能為指導(dǎo)實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)。因此，真菌多樣性研究方法的不斷完善必將推動(dòng)真菌多樣性研究的快速發(fā)展。

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