邵衛(wèi)緒

（山東省蓬萊市中醫(yī)院急診科，蓬萊 265600）

基于代謝組學(xué)的抗心絞痛常見藥物的比較

邵衛(wèi)緒

（山東省蓬萊市中醫(yī)院急診科，蓬萊 265600）

目的 采用基于氣相色譜－質(zhì)譜 （GC－MS）的代謝組學(xué)技術(shù)比較并評價單硝酸異山梨酯，曲美他嗪，復(fù)方丹參滴丸三種藥物抗心絞痛作用機(jī)制。方法 40只SD大鼠分為模型組、正常對照組、單硝酸異山梨酯組、曲美他嗪組、復(fù)方丹參滴丸組5組，采用GC－MS技術(shù)對不同組別大鼠的血漿進(jìn)行分析。并利用SIMCA－P軟件對不同組之間代謝產(chǎn)物含量變化進(jìn)行主成分分析 （PCA）和偏最小二乘法判別分析 （PLS－DA），初步揭示心絞痛生物標(biāo)志物，為心絞痛藥物篩選提供新的方法。結(jié)果 代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示，模型組大鼠血漿中琥珀酸、延胡索酸、葡萄糖、檸檬酸、乳酸、尿素、甘氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸及肌苷等內(nèi)源性代謝物有差異性變化（P＜0.05），可視為心絞痛生物標(biāo)志物。PCA和PLS－DA統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示曲美他嗪組距離正常對照組最近，且所能回調(diào)的標(biāo)志物較其他兩組多，其抗心絞痛效果較優(yōu)。結(jié)論 三種藥物都有明顯的抗心絞痛效果，曲美他嗪效果較優(yōu)；運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)分析了三種藥物抗心絞痛有關(guān)標(biāo)志物的調(diào)節(jié)作用并對其機(jī)制進(jìn)行了初步比較研究，為藥物藥效的評價提供了新思路和新方法。

代謝組學(xué)；心絞痛；氣相色譜－質(zhì)譜

心絞痛是臨床常見疾病，是由于冠狀動脈粥樣硬化引起冠狀動脈管腔狹窄、部分堵塞或冠狀動脈痙攣而造成心肌供氧不足所致［1－2］。目前，單硝酸異山梨酯，曲美他嗪，復(fù)方丹參滴丸為我院臨床上應(yīng)用最廣的三種抗心絞痛藥物，其在臨床上均對心絞痛具有確切的療效［3］。但目前對三者的研究大多是從臨床角度進(jìn)行探討，不能全面反映藥物調(diào)節(jié)機(jī)體的過程，因此，本實(shí)驗(yàn)采用GC－MS技術(shù)分析單硝酸異山梨酯組、曲美他嗪組、復(fù)方丹參滴丸組大鼠的血樣成分變化，結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析，聯(lián)系機(jī)體物質(zhì)和能量代謝的代謝通路和代謝網(wǎng)絡(luò)［4］，進(jìn)一步闡釋三者的干預(yù)機(jī)制，具有整體性和多靶點(diǎn)性，以期為臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD成年雄性健康大鼠40只，體重 （200±20）g，購于北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司，動物許可證：SCXK （京）2011－0004。

1.2 儀器 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 （GCMS－QP2010，日本島津公司）；DB－5MS氣相毛細(xì)管色譜柱 （安捷倫科技有限公司）；QL－901型微型漩渦混合器 （江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorious BT 25S型電子分析天平 （北京賽多利斯儀器有限公司）；CENCO型渦旋儀 （荷蘭Breda公司），Biofuge Stratos型低溫高速離心機(jī) （德國Heracus公司）。

1.3 試劑與試藥 單硝酸異山梨酯片 （山東魯南貝特制藥有限公司）；鹽酸曲美他嗪片 （施維雅制藥有限公司）；復(fù)方丹參滴丸 （天津天士力股份有限公司）；衍生化試劑：BSTFA＋1%TMCS，甲氧胺鹽酸鹽，吡啶 （美國Sigma公司）；屈臣氏蒸餾水。

1.4 方法

1.4.1 動物造模與分組 取雄性SD大鼠，參照文獻(xiàn)方法，采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支誘導(dǎo)心絞痛模型［5］。取造模成功大鼠32只，將其隨機(jī)分為4組，包括模型組、單硝酸異山梨酯組，曲美他嗪組，復(fù)方丹參滴丸組，每組8只；另取8只未施行手術(shù)的SD雄性大鼠為正常對照組。

1.4.2 給藥方法及取材 造模第二天開始灌胃給藥，每日1次，復(fù)方丹參滴丸組100mg/kg，單硝酸異山梨酯組、曲美他嗪組均為20mg/kg，模型組、正常對照組給予等量的飲用水，1mL/kg。連續(xù)給藥4周，于第28天，眼眶取血，肝素鈉抗凝，取血漿，置－80℃冰箱保存。

1.4.3 樣本的GC－MS分析 GC－MS樣本預(yù)處理：實(shí)驗(yàn)前1h取大鼠血漿樣品常溫下解凍溶解，吸取100∶L血漿于離心管中；加入10μL內(nèi)標(biāo) （十七酸甲醇溶液，6mg/mL），再加入有機(jī)溶劑 （甲醇∶氯仿＝3∶1）300μL，渦旋震蕩1min；將混合液置于－20℃冰箱中10min，取出后離心 （13000r/min，4℃）10min，取上清液于進(jìn)樣瓶中，氮?dú)獯蹈?。取揮干的樣品加入20mg/mL甲氧胺吡啶溶劑50μL混勻；在30℃下?lián)u床 （200rpm）中反應(yīng)2h；加入80μL的BSFTA （含1%TMCS），振蕩30s；70℃水浴反應(yīng)1h后渦旋混勻，室溫下放置1h后待GC/MS進(jìn)樣分析。

色譜和質(zhì)譜條件：氣相條件：色譜柱：DB－5MS（30m×0.25mm×0.25μm）毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度：260℃；分流比為2∶1；升溫程序：80℃，保持2min，以10℃/min升至140℃，以4℃/min升至240℃，再以10℃/min升至280℃，保持3min；載氣流速：1.0mL/min；載氣：高純度氦氣；進(jìn)樣量：1μL。質(zhì)譜條件：接口溫度：280℃；電離方式：EI；離子源溫度：220℃；電子能量70 eV；掃描范圍：50～600 m/z。

1.4.4 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析 根據(jù)GC/MS總離子流圖中各峰保留時間挑選有效物質(zhì)峰，對各峰進(jìn)行積分。利用NIST 5質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對總離子流圖中各個物質(zhì)峰對應(yīng)的內(nèi)源性物質(zhì)進(jìn)行鑒定，內(nèi)源性物質(zhì)含量直接用圖中相應(yīng)物質(zhì)峰的峰面積來表示。將每個樣本的處理結(jié)果導(dǎo)入SIMCA－P 12.0軟件進(jìn)行主成分分析 （PCA）以及偏最小二乘判別分析 （PLS－DA）。通過載荷圖中的VIP值 （每個主成分變量對分開各組的貢獻(xiàn)大小）來尋找生物標(biāo)志物。VIP值＞1被認(rèn)為是判斷有意義物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 GC－MS分析結(jié)果 總離子流圖：大鼠血漿GC－MS分析總離子流圖如下圖1所示。

圖1 大鼠血漿GC－MS分析總離子流圖

2.2 代謝物鑒定 利用NIST 5質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對內(nèi)源性代謝物作鑒定，以通常匹配度＞80%的鑒定結(jié)果作為較為可信的物質(zhì)。挑選共有峰后發(fā)現(xiàn)大鼠血漿內(nèi)共有內(nèi)源性代謝物29種，包括：乳酸、3－羥基丁酸、纈氨酸、磷酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、賴氨酸、肌醇、甘氨酸、絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、尿素、丙氨酸、葡萄糖、核糖醇、亞油酸、油酸、十六烷酸、延胡索酸、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、次黃嘌呤、黃嘌呤、肌苷、脯氨酸、甜菜堿。

2.3 各組間模式識別分析 正常對照組、模型組和三種藥物干預(yù)組之間PCA及載荷圖統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明 （見圖2，4），模型組、正常對照組、單硝酸異山梨酯組、曲美他嗪組、復(fù)方丹參滴丸組之間基本無交叉和重疊。同時三種藥物干預(yù)組均有向正常對照組靠近的趨勢。其中，曲美他嗪組距離正常對照組較近，其抗心絞痛效果較優(yōu)。

采用PLS－DA對正常組、模型組兩組間差異代謝物進(jìn)行分析得出，與正常對照組對比，模型組中肌醇、尿素、次黃嘌呤、黃嘌呤、肌苷、乳酸、3－羥基丁酸、磷酸、亞油酸、葡萄糖、油酸、核糖醇、十六烷酸濃度升高；纈氨酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、賴氨酸、甘氨酸、絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、延胡索酸、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甜菜堿濃度降低。從VIP值觀察重要的依次是琥珀酸、延胡索酸、葡萄糖、檸檬酸、乳酸、尿素、甘氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸及肌苷。在曲美他嗪組大鼠血漿中，3－羥基丁酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、絲氨酸、延胡索酸、谷氨酸、色氨酸、肌苷、葡萄糖10種代謝產(chǎn)物含量有顯著性差異 （與模型組比較，P＜0.05）。單硝酸異山梨酯組大鼠血漿中絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、甘氨酸5種代謝產(chǎn)物與模型組比較含量顯著增加。復(fù)方丹參滴丸組大鼠血漿中絲氨酸、葡萄糖、亞油酸、油酸、十六烷酸、次黃嘌呤、黃嘌呤7種代謝產(chǎn)物回調(diào)至接近于正常水平。

圖2 五組大鼠血漿之間的PCA主成分分析圖

圖3 代謝物變化模式識別得分圖

圖4 組間載荷圖

2.4 各組發(fā)生改變的代謝產(chǎn)物含量比較 由表1可以看出，模型組大鼠給予藥物治療后，總體水平上觀察，標(biāo)志物含量均呈現(xiàn)由模型組到正常水平的回復(fù)趨勢。每種藥物對標(biāo)志物水平的影響又不盡相同。這說明，3種藥物對于心絞痛均有較好的治療效果，但由于每種藥物的作用機(jī)制不同，不同類型的藥物對標(biāo)志物的干預(yù)具有特異性。其中，曲美他嗪組所回調(diào)的標(biāo)志物種類及含量都較其他兩組多，其抗心絞痛效果較優(yōu)。

表1 各組間差異代謝物變化

3 討論

3.1 正常對照組和模型組的生物標(biāo)志物指認(rèn) 與正常對照組比較發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血漿代謝譜發(fā)生了顯著性變化，其中延胡索酸等15種代謝物的表達(dá)低于正常對照組中的表達(dá)；而葡萄糖等14種代謝物高于正常對照組的含量。其中，模型組大鼠血漿中琥珀酸、延胡索酸、葡萄糖、檸檬酸、乳酸、尿素、甘氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸及肌苷等內(nèi)源性代謝物有差異性變化，可視為心絞痛生物標(biāo)志物。

3.2 三種藥物對潛在生物標(biāo)志物的回歸調(diào)節(jié)分析 從傳統(tǒng)的作用機(jī)制上看，單硝酸異山梨酯和曲美他嗪是常見的硝酸酯類和曲美他嗪類西藥，分別通過松弛血管平滑肌和改變能量代謝途徑發(fā)揮作用［5］，復(fù)方丹參滴丸是臨床常見的中藥制劑，活血化瘀、理氣止痛，具有擴(kuò)張冠狀動脈、增加冠脈血流量的作用［6－7］。

本實(shí)驗(yàn)心絞痛模型組大鼠經(jīng)過單硝酸異山梨酯干預(yù)后有5種代謝物與模型組相比發(fā)生顯著性改變：甘氨酸、絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸。推測單硝酸異山梨酯對氨基酸代謝通路具有一定的調(diào)節(jié)作用。曲美他嗪干預(yù)后有10種代謝物質(zhì)變化顯著，其中琥珀酸等4項(xiàng)指標(biāo)與細(xì)胞內(nèi)三羧酸循環(huán)密切相關(guān)。其水平的上升考慮是心肌細(xì)胞有氧代謝功能的恢復(fù)。而絲氨酸、谷氨酸、色氨酸等則通過幾步轉(zhuǎn)化間接干預(yù)糖酵解、三羧酸循環(huán)和戊糖磷酸途徑。復(fù)方丹參滴丸組與模型組對比，變化的代謝物有絲氨酸、葡萄糖、亞油酸、油酸、十六烷酸、次黃嘌呤、黃嘌呤7種內(nèi)源性代謝物，其中涉及到糖代謝、嘌呤代謝、脂類代謝等多種代謝通路，說明復(fù)方丹參滴丸具有多組分、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的心血管保護(hù)作用。

代謝組學(xué)是研究許多病癥發(fā)病機(jī)制和作用機(jī)制的良好平臺，能夠全面研究機(jī)體新陳代謝活動鏈上的終產(chǎn)物的變化，然后將這些多維代謝軌跡與病理生理過程中的生物學(xué)事件聯(lián)系起來，反映生物體系的狀態(tài)［9］?；贕C－MS的代謝組學(xué)技術(shù)從代謝角度研究三種常見抗心絞痛藥物治療機(jī)制，為將來評價和預(yù)測不同治療方式的遠(yuǎn)期療效提供了一定的參考價值和理論依據(jù)［10］。

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Metabolomic Based Comparison Study on Angina Pectoris Treated with Common Drugs

Shao Weixu
（Emergency Department，Traditional Chinese Medicine Hospital of Penglai，Penglai265600，China）

ObjectiveTo compare the different mechanism between isosorbide 5－mononitrate，Trimetazidine and Compound Danshen Dropping Pills in treatment for angina pectoris using GC－MS by metabolomic approach.MethodsForty SD rats were equally divided into the model group，the blank control group，the isosorbide 5－mononitrategroup，the Trimetazidine group，and the Compound Danshen Dropping Pills group.Changes of metabolite contents were analyzed among different groups using GC－MS via principal component analysis（PCA）and partial least squares analysis（PLS－DA）using the SIMCA－P software.Biomarkers of angina pectoris injury are initially revealed.The metabolomics study could offer a new method and tool for angina pectoris.ResultsMetabolomic analysis showed that the Trimetazidine group located closer to the blank control group，showing better efficacy than the other two groups.More perturbed metabolites were reversed by Trimetazidine group.In the plasma of rats，succinic acid，2－butenedioic acid，d－glucose，citric acid，lactic acid，urea，glycine，phenylalanine，l－isoleucine，creatinine，and so on had significant changes before and after myocardial ischemia.ConclusionsThree drugs have significant efficacy，and Trimetazidine shows best effect.Metabolomic approach was applied in this study to analyze the regulation of biomarkers and compare the mechanisms of the three drugs.These results provide new methods for the evaluation of drug efficacy.

metabolomics；Angina pectoris；Gas chromatography－mass spectrometry

10.3969/j.issn.1672－2779.2014.10.060

1672－2779（2014）－10－0100－03

蘇 玲 本文校對：張春華

2014－02－15）