趙俊杰 朱小峰 閆福華

hVEGF基因修飾的組織工程化復合物修復牙周組織缺損的實驗研究

趙俊杰 朱小峰 閆福華

目的探討hVEGF165基因修飾的BMSCs在SD大鼠急性牙周缺損模型中對牙周組織再生的作用。方法人工構(gòu)建SD大鼠急性牙周缺損模型。設(shè)以下6組（36只SD大鼠，n=6）：空白對照（A組）；單純e-PTFE膜（B組）；BME+e-PTFE膜（C組）；BMSCs+BME+e-PTFE膜（D組）；空轉(zhuǎn)BMSCs+BME+e-PTFE膜（E組）；hVEGF165基因修飾的BMSCs+BME+e-PTFE膜（F組）。分別將轉(zhuǎn)染hVEGF165基因的BMSCs與未轉(zhuǎn)染的BMSCs接種于膠原膜BME-10X后，按各分組植入人工牙周缺損內(nèi)，并以空白膠原膜和空載體為對照。4周后取材作病理切片，HE染色觀察牙周組織再生情況，測量新生牙槽骨面積、新生牙骨質(zhì)面積以及新生牙周膜寬度，結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果各組均可見不同程度的牙周組織再生，A組、B組和C組三組新生牙槽骨面積（NB）、新生牙骨質(zhì)面積（NC）和新生牙周膜寬度（NP）均無明顯差別（P>0.05）；與A組相比，D組、E組、F組的NB、NC均有顯著增加（P<0.05）；與E組相比，轉(zhuǎn)染有hVEGF165基因組（F組）的NB、NC和NP均有顯著增加（P<0.05）。結(jié)論hVEGF165基因轉(zhuǎn)染BMSCs與膠原膜復合物可促進大鼠牙周組織再生。

人血管內(nèi)皮細胞骨髓基質(zhì)干細胞組織工程牙周組織再生膠原膜急性牙周缺損

血管內(nèi)皮生長因子(Vascularendothelial growth factor，VEGF)是內(nèi)皮細胞的特異性絲裂原，是作用最強、特異性最高的血管形成和血管通透性誘導因子，與骨形成有直接關(guān)系，在成骨活動中具有積極作用；另外，VEGF還有強大的血管生成和骨再生能力[1]。骨髓基質(zhì)干細胞（Bone marrow stromalcells，BMSCs）具有多向分化潛能，可向成骨細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞及成肌細胞分化。獲取方法簡單可靠，創(chuàng)傷小，體外培養(yǎng)可獲得大量擴增[2]。作為同源細胞治療，無免疫原性，易于自體回植，是組織工程化骨理想的種子細胞。應(yīng)用骨髓基質(zhì)細胞來表達基因有許多優(yōu)點，其細胞表面有骨誘導蛋白的受體，具有明確的成骨潛能[3]。BMSCs在不同類型生長因子的作用下，可向相應(yīng)的細胞類型分化，促進組織的成熟。VEGF可促進體外培養(yǎng)BMSCs的增殖并向成骨表型分化，且不同濃度的VEGF可使其特定地分化成靜脈或動脈血管內(nèi)皮細胞[4]。本研究試圖通過人血管內(nèi)皮生長因子（hVEGF165）基因修飾SD大鼠BMSCs，在體外將其與膠原膜BME-10X復合構(gòu)建組織工程化復合物，植入SD大鼠下頜的人工牙周組織急性缺損區(qū)，通過組織學觀察和測量，進一步了解、分析評價其對牙周組織再生的影響，為將基因強化的牙周組織工程技術(shù)應(yīng)用于牙周組織缺損的修復提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量（130±20）g，清潔級，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。動物許可證號：SCXK(滬)2007-0005。大鼠由南京軍區(qū)福州總醫(yī)院動物比較醫(yī)學科（清潔級實驗動物中心）飼養(yǎng)管理。

DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國）；胰蛋白酶（Gibco，美國）；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；L-谷氨酰胺（Sigma，美國）；磷酸緩沖生理鹽水（PBS，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；二甲基亞砜（Invitrogen，美國）；醫(yī)用組織引導再生膠原膜BME-10X（福建省博特生物科技有限公司）；e-PTFE膜（上海市塑料研究所）；瞬康醫(yī)用膠（北京瞬康科技發(fā)展有限公司）；鹽酸氯胺酮（恒瑞醫(yī)藥）；阿替卡因腎上腺素注射液（塞特力，法國）；多聚甲醛（天津市百世化工有限公司）；10%EDTA脫鈣液（汕頭市西隴化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞載體復合物的制備

用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA將轉(zhuǎn)染重組腺病毒Ad5-hVEGF165-EGFP的BMSCs細胞和空轉(zhuǎn)組的細胞消化后，調(diào)整細胞密度，以5×106cells/mL的密度接種于已預(yù)濕的4 mm×2 mm的膠原膜BME-10X上，每片接種10μL，置37℃孵箱中，2 h后加入2 mL含10%FBS培養(yǎng)液，隔日換液，倒置顯微鏡下觀察細胞附著情況，培養(yǎng)2 d后用于實驗。

1.2.2 實驗分組

實驗用雄性SD大鼠36只，隨機分為6組，每組6只。A組：空白對照；B組：單純e-PTFE膜；C組：BME+e-PTFE膜；D組：BMSCs+BME+e-PTFE膜；E組：空轉(zhuǎn)BMSCs+BME+e-PTFE膜；F組：hVEGF165基因修飾的BMSCs+BME+e-PTFE膜。

1.2.3 細胞載體復合物治療SD大鼠牙周急性缺損

SD大鼠牙周急性缺損的制備：參照趙欣等[5-7]的方法，大鼠稱重后，氯胺酮（100 mg/K g）腹腔麻醉，背部固定，取仰臥位，在大鼠右側(cè)下頜區(qū)備皮、消毒，必藍注射液0.2 m L術(shù)區(qū)局部浸潤麻醉，以減少出血。常規(guī)鋪巾，暴露術(shù)區(qū)，在下頜骨下緣距離口角約1 cm處切開皮膚，往近遠中方向延長切口至2 cm。逐層分離組織，于下頜骨下緣處暴露咬肌下緣，切斷咬肌附著，分離咬肌和骨膜，由下向上骨膜下翻瓣，暴露下頜骨的頰側(cè)骨面。確定下頜第1、2磨牙的相對位置，使用電動打磨手機，低速逐步磨除頰側(cè)表層骨皮質(zhì)，制備近遠中向4 mm，頰舌向1 mm，垂直向2 mm的缺損。暴露第一磨牙的頰根，測量缺損大小后，以銳利的小刮匙刮除根面的牙周膜、牙骨質(zhì)和表層牙本質(zhì)，添加抗生素的生理鹽水沖洗創(chuàng)面（圖1）。

根據(jù)實驗分組處理各個缺損，將組織工程復合物放置于骨缺損處，然后覆蓋e-PTFE膜（使得膜邊緣超出骨缺損邊緣約0.5 mm），將e-PTFE膜四周用瞬康醫(yī)用膠固定，用含抗生素的生理鹽水沖洗3次。

分層縫合后，用濕紗布在創(chuàng)面加壓5~10 min，使創(chuàng)面下方的軟組織與骨面緊密貼合，減少出血及死腔形成，局部涂金霉素眼膏。同時，腹腔注射青霉素40萬U，術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素40萬U/d，預(yù)防感染。嚴密觀察SD大鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動及傷口愈合情況。

1.2.4 標本制備

術(shù)后4周取右側(cè)下頜骨標本，即刻置于新鮮配置的4%多聚甲醛中固定7 d，流水沖洗24 h，將標本置于10%EDTA脫鈣液中脫鈣14 d，每3天更換一次脫鈣液。標本脫鈣完全后用流水沖洗24 h，梯度脫水（30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇各24 h，無水乙醇、正丁醇各12 h），浸蠟6 h，常規(guī)石蠟包埋。每個標本按照4μm厚度進行頰舌向冠狀切片、修片，直至鏡下觀察到第一磨牙頰側(cè)根面的缺損出現(xiàn)時開始連續(xù)切片，每間隔50μm取1張，挑選其中5張進行組織學測量和分析。

1.2.5 組織學觀察和測量

將切片HE染色,正置顯微鏡下觀察新生牙周組織再生情況，每個標本取5張連續(xù)切片進行拍照，Image-Pro Plus6.0進行組織學測量。測量指標包括：裸露于第一磨牙頰側(cè)根面上新生牙槽骨（new alveolar bone formation，NB）、新生牙骨質(zhì)（new cementum formation，NC）的面積以及新生牙周膜（new periodontal ligament，NP）的寬度，并對測量結(jié)果進行統(tǒng)計學分析（圖2）。

1.2.6 統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理；所有數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 動物大體觀察

術(shù)后2 h大鼠逐漸恢復活動。術(shù)后1 d，各組大鼠右側(cè)面部均出現(xiàn)水腫，部分大鼠右眼眶周圍皮下出現(xiàn)淤血，傷口縫線未脫落，大鼠精神萎靡，毛發(fā)略灰暗，進食減少。術(shù)后7 d水腫消退，傷口愈合良好，大鼠飲食活動恢復正常。術(shù)后2周，術(shù)區(qū)縫線大都自行脫落，傷口愈合良好。術(shù)后4周取材，解剖下頜牙周缺損區(qū)域，肉眼觀察可見e-PTFE膜貼附完好，少數(shù)e-PTFE膜有松動，但未發(fā)現(xiàn)脫落。

圖1 SD大鼠牙周急性缺損模型示意圖Fig.1 Sketch map of acute periodontal fenestration defects in SD rats

2.2 組織學觀察

所有標本切片，HE染色后在光學顯微鏡下進行組織學觀察，可見各組覆蓋的屏障膜e-PTFE膜保存完整，周圍有大量炎癥細胞浸潤；各實驗組的支架材料BME膠原膜基本被吸收，沒有發(fā)現(xiàn)材料殘留。6個組均有不同程度的牙周組織再生，對空白對照組（A組）和單純e-PTFE膜組（B組）而言，其余各組有更多新生牙槽骨形成，新生骨樣組織填充于下頜牙周急性缺損部位，但新生的牙槽骨礦化程度相對較低，與周圍骨組織無明顯界限，可見新生骨的表面密集排列胞核大、胞漿豐富的成骨細胞（圖3）?？瞻讓φ战M可見新生的牙槽骨形成，其間未見到新生血管；單純e-PTFE膜組（B組）和單純膠原膜組（C組）只有少量新生骨，新生骨結(jié)構(gòu)排列疏松，骨小梁纖細，且礦化程度較低，在新生骨周圍可見大量的結(jié)締組織，無新生血管形成；細胞組和空載組（D組和E組）可見新生骨形成，少量小血管分布其間，板層骨量少；轉(zhuǎn)染組（F組）可見大量新骨形成，相互連接成片，內(nèi)可見板層骨形成，在新生牙槽骨的近牙根側(cè)可見新生牙周膜形成，鏡下可見新生牙周膜為新生結(jié)締組織，平行或斜形附著于新生牙槽骨或新生牙骨質(zhì)，內(nèi)含較多新生的血管，牙根表面可見呈連續(xù)或不連續(xù)覆蓋于裸露牙根表面的新生牙骨質(zhì)，厚薄不均，偶可見細胞型牙骨質(zhì)（圖4）。

2.3 組織學觀察

各組新生牙槽骨、新生牙骨質(zhì)面積和新生牙周膜寬度測量結(jié)果顯示A、B、C三組之間新生牙槽骨面積（NB）、新生牙骨質(zhì)面積（NC）和新生牙周膜寬度（NP）均無明顯差別（P>0.05）；與A組相比，D、E、F組NB、NC均有顯著增加（P<0.05）；與E組相比，轉(zhuǎn)染有hVEGF165基因組（F組）的NB、NC和NP均有顯著增高（P<0.05）。

圖2 頰側(cè)根面新生牙槽骨面積測量示意圖Fig.2 Schematic diagram of new alveolar bone area measurement on buccalroot

圖3 術(shù)后4周各組標本組織學觀察（FCT：纖維結(jié)締組織；NB：新生牙槽骨；NC：新生牙骨質(zhì)；NP：新生牙周膜）Fig.3 Histological observation in each group 4 weeks after operation (FCT:fibrous connective tissue;NB:new alveolar bone;NC:new cementum;NP:new periodontium)

圖4 細胞型牙骨質(zhì)（箭頭所示）Fig.4 Cytoid cementum(Indicated by the arrow)

3 討論

建立實驗性牙周缺損模型是牙周組織工程研究的前提和條件，目前常用的建立方式有兩種：①外科手術(shù)造成的急性缺損；②菌斑、牙膠等各種因素誘導的慢性缺損。研究證明，急性缺損的牙周組織修復程度較高，數(shù)值相對較穩(wěn)定[8]。大鼠的牙周組織結(jié)構(gòu)、病理生理都與人類相似，其口腔內(nèi)上下左右各有3個磨牙，齦溝內(nèi)被覆角化上皮，且操作簡便，易于飼養(yǎng)，成活率高，繁殖周期短，價格便宜。因此在牙周病的研究中，大鼠作為實驗性牙周炎模型仍是理想選擇[9]。Huang等[10]應(yīng)用SD大鼠急性牙周缺損模型，研究不同濃度的BMP-6修復缺損的能力，結(jié)果顯示在移植術(shù)后28 d就可出現(xiàn)完全的骨再生。林泓兵等[11]應(yīng)用負載人牙周膜細胞的生物活性復合膜覆蓋在大鼠急性牙周組織缺損處，發(fā)現(xiàn)生物活性復合膜能促進牙周組織生長，對牙周骨組織缺損修復具有顯著作用。本實驗選擇SD大鼠進行體內(nèi)研究，采用口外入路人工制備急性牙周缺損模型[5-7]，在人工去除下頜第一磨牙頰側(cè)牙槽骨后，暴露其頰根，刮除根面牙周膜、牙骨質(zhì)和表層牙本質(zhì)，形成4 mm×2 mm大小的矩形缺損，然后根據(jù)實驗設(shè)計將不同的細胞-材料復合物植入牙周缺損中，研究hVEGF165基因修飾的BMSCs對SD大鼠牙周組織缺損修復的影響。

我們在實驗中選用e-PTFE膜覆蓋于組織工程化復合物表面，是希望利用e-PTFE膜的屏障作用制造出一個置于軟組織和骨缺損之間相對封閉的組織環(huán)境，阻止容易干擾骨形成且遷移速度較快的纖維結(jié)締組織細胞進入骨缺損區(qū)，充分發(fā)揮組織工程化復合物的潛在生長能力，實現(xiàn)牙周組織的完全再生。

傳統(tǒng)的GTR手術(shù)切口都在口內(nèi)，口腔內(nèi)細菌容易通過傷口感染術(shù)區(qū)，導致實驗失敗。Tempro等[12]認為屏障膜在GTR術(shù)后1~2周內(nèi)容易暴露在口腔中，增加了細菌定植的機會，會對牙周再生產(chǎn)生不良影響。因此，我們在制備SD大鼠牙周模型時，選擇口外徑路，避免口腔內(nèi)細菌的侵入和牙齦上皮細胞長入缺損部位對實驗結(jié)果造成干擾。

本實驗表明，在SD大鼠體內(nèi)，經(jīng)過hVEGF165基因修飾后的BMSCs促進牙周組織再生的效果明顯優(yōu)于單純細胞組和空轉(zhuǎn)組，負載BMSCs的組織工程化復合物促進牙周組織再生的能力明顯優(yōu)于單純膠原膜組。

骨的形成和修復是以成骨細胞為中心，由破骨細胞、血管內(nèi)皮細胞、骨細胞及細胞外基質(zhì)共同參與，并受多種生長因子和激素調(diào)控的復雜生理活動。血管內(nèi)皮細胞生長因子在骨再生與代謝中的作用主要體現(xiàn)在3個方面：①通過促進內(nèi)皮細胞增殖、血管生成，調(diào)節(jié)骨組織血供并參與骨的發(fā)育形成；②通過調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的活性促進骨組織的再生、修復和重建；③作為旁分泌因子參與骨形成代謝。有研究發(fā)現(xiàn)，局部使用rhVEGF具有增強血管生成和骨再生的能力，認為其在骨形成和維持血管系統(tǒng)方面具有重要的作用[13]。骨再生和生物材料的骨結(jié)合都依賴于血管生成和血管化，在血管生成的不同時期，對VEGF的需求不一。血管生成早期，高濃度的VEGF可促進內(nèi)皮細胞的分化、增殖和聚集形成內(nèi)皮管；血管生成的后期，內(nèi)皮細胞的增殖是次要的。若在血管生成的整個過程中，都使用高濃度的VEGF，可能因內(nèi)皮細胞的分化、增殖和聚集形成相對過量的內(nèi)皮管，造成血管畸形，形成畸形而無功能的組織。Wernike等[1]在觀察體外和裸鼠體內(nèi)成骨實驗中發(fā)現(xiàn)，持續(xù)釋放低濃度的VEGF有利于骨再生。本實驗結(jié)果表明，hVEGF165基因修飾的BMSCs和膠原膜復合形成的組織工程化復合物，可以促進牙周組織再生，但其作用機制如何，hVEGF165在體內(nèi)微環(huán)境下如何誘導BMSCs分化，是否存在時序性等，尚有待進一步的研究證實。

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hVEGF Gene Modified Tissue-engineered Compound in the Reconstruction of Periodontal Tissue Defects in SD Rats

ZHAO Junjie1,ZHU Xiaofeng2,YAN Fuhua1.1 Institute and Hospital of Stomatology,Nanjing University School of Medicine,Nanjing 210008,China;2 Department of Oral and Maxillofacial Surgery,The First Affiliated Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China.Corresponding author:YAN Fuhua(E-mail:fhyan2005@126.com).

ObjectiveTo investigate the effects of hVEGF165 gene transfected bone marrow stem cells(BMSCs)in the repair of periodontal defect in rats.MethodsA model of rat periodontal defect was established.The gene-modified tissueengineered complex,constructed by transfected BMSCs and BME-10X,was implanted into subcutaneous sites in SD rats. The 36 SD rats were divided into 6 groups randomly(n=6):control(A and B),blank collagen membranes(C),BMSCs with collagen membranes(D),empty adenoviral vector transfected BMSCs with collagen membranes(E),and hVEGF165 transfected BMSCs with collagen membranes(F).BMSCs with different treatments were seeded on the collagen membranes. The collagen membrane with or without cells was transplanted into an acute periodontal defect model respectively,and then the defects were covered with e-PTFE membranes.Histological and morphometric analysis were performed 4 weeks after operation,the area of new alveolar bone(NB),cementum area(NC)and the width of periodontal ligament(NP)were measured and compared.ResultsDifferent degrees of periodontal tissue regeneration were observed in all groups.There were no differences of the area of newly formed alveolar bone(NB),cementum area(NC)and the width of periodontal ligament(NP) among the 3 groups(A,B,C).NB and NC in group D,E,F were significantly increased compared with group A(P<0.05). NB,NC and NP in group F were significantly increased compared with group E(P<0.05).ConclusionThe BME-10Xshowed a good biocompatibility with BMSCs transfected by hVEGF165.BMSCs transfected by hVEGF165 gene enhanced periodontal tissue regeneration in models of periodontal defect.

Vascular endothelial cells;Bone marrow stromal cells;Tissue engineering;Periodontal regeneration; Collagen membrane;Acute periodontal defect

Q813.1+1

A

1673－0364（2014）05－0250－05

2014年4月11日；修復日期：2014年6月2日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.05.004

南京市國際合作項目（201303051）；福建省教育廳資助項目（JK2010023）。

210008江蘇省南京市南京大學口腔醫(yī)學院（趙俊杰，閆福華）；350004福建省福州市福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院（朱小峰）。

閆福華（E-mail：fhyan2005@126.com）。

注：趙俊杰，朱小峰為共同第一作者。