袁麗麗 馬登殿 孔佑華

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，濟(jì)寧 272029)

近些年，促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用[1]研究較多。本實(shí)驗(yàn)鏡下取大鼠14d天胚胎腦皮質(zhì)行體外培養(yǎng)，鑒定為神經(jīng)干細(xì)胞(nerual stem cells,NSCs)之后培養(yǎng)基中加入不同濃度的EPO繼續(xù)體外培養(yǎng)，觀察NSCs向神經(jīng)元方向分化的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

成年雌雄未經(jīng)產(chǎn)SD大鼠晚8：00合籠，次日晨8：00查到精子者記為E0d。

懸浮培養(yǎng)基：DMEM/F12(1∶1，Hyclone)，20 ng/mlEGF(Sigma)，20 ng/mlbFGF(Sigma)，2%B27(Gibco)，100 u/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素。貼壁分化培養(yǎng)基：DMEM/F12(1∶1，Hyclone)，10%FBS(杭州四季青)，100u/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素。

1.2 方法

1.2.1NSCs培養(yǎng)和鑒定

1.2.1.1NSCs的分離和傳代及自然分化 取孕14d(E14d)SD大鼠胚胎腦皮質(zhì)，用袁麗麗等[2-3]培養(yǎng)方法先懸浮培養(yǎng)傳代3次，第3代(P3)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)7d，收集部分細(xì)胞離心后待做電鏡標(biāo)本，其余懸浮細(xì)胞移入涂有L-多聚賴氨酸包被蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中加入分化培養(yǎng)基。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～8h，隨機(jī)選取培養(yǎng)板，將蓋玻片固定，待行nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色。其余培養(yǎng)板繼續(xù)行分化培養(yǎng)，7d后取出細(xì)胞爬片固定，待行神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glia fibrillary acid protein，GFAP)、微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2)免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

1.2.1.2免疫細(xì)胞化學(xué)染色 Nestin、GFAP、MAP2進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色[2]。

1.2.2EPO摻入實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1分組 第3代NSCs懸浮及其后貼壁分化培養(yǎng)基中添加EPO，根據(jù)EPO終濃度0.5、5、50、500u/ml分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)對(duì)照組(不加EPO)。培養(yǎng)方法同上。

1.2.2.2免疫熒光染色 NSCs爬片7d固定行MAP2免疫熒光染色[3]。后行激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。每組隨機(jī)取4張蓋玻片，每張400倍鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野計(jì)數(shù)MAP2陽性細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算視野中MAP2陽性細(xì)胞百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，各組率的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞鑒定

2.1.1倒置相差顯微鏡及電鏡觀察結(jié)果 分離E14d鼠胚腦皮質(zhì)得到單細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)>96%，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)。第5～7天，形成神經(jīng)球，可傳代。電鏡觀察細(xì)胞核大，細(xì)胞器很少，核質(zhì)比較大。見圖1。

圖1 NSCs懸浮生長(zhǎng)7d電鏡照片(×60000)

2.1.2免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察結(jié)果 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，nestin在神經(jīng)球內(nèi)細(xì)胞胞漿呈陽性表達(dá)，細(xì)胞漿被染成棕褐色 ，見圖2。

圖2 神經(jīng)球爬片6h，免疫細(xì)胞化學(xué)染色示神經(jīng)球內(nèi)細(xì)胞nestin表達(dá)陽性(×400)

分化培養(yǎng)7d，GFAP：在部分細(xì)胞胞漿及突起中呈陽性表達(dá)，被染成棕褐色，胞體較大、突起粗而短，見圖3。MAP2：在部分細(xì)胞胞漿及突起中呈陽性表達(dá)，細(xì)胞胞漿及突起呈棕褐色，見圖4。

圖3 神經(jīng)球分化7d，免疫細(xì)胞化學(xué)染色示GFAP陽性細(xì)胞(×400)

圖4 神經(jīng)球分化7d，免疫細(xì)胞化學(xué)染色示MAP2陽性細(xì)胞(×400)

2.2 EPO摻入實(shí)驗(yàn)

2.2.1光鏡觀察 加入EPO分化培養(yǎng)，細(xì)胞透亮，折光較好，見圖5，部分細(xì)胞伸出的突起細(xì)而長(zhǎng)，隨時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞突起形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。

圖5 EPO 5u/ml組，神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)4d光鏡照片(×100)

2.2.2MAP2免疫細(xì)胞熒光化學(xué)染色及共聚焦顯微鏡觀察 加入EPO分化培養(yǎng)7d，MAP2免疫細(xì)胞熒光染色共聚焦顯微鏡觀察，示部分細(xì)胞胞漿及突起呈綠色熒光，MAP2表達(dá)陽性，見圖6。

圖6 EPO 5u/ml組，NSCs免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色， 示MAP2陽性細(xì)胞(×400)

各實(shí)驗(yàn)組對(duì)NSCs向神經(jīng)元方向分化的影響如表1所示。

表1 加入EPO各組MAP2在神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)

注：*P<0.05，說明EPO濃度不同時(shí)，NSCs向神經(jīng)元分化的比例不同或不全相同。

添加EPO各組分別與對(duì)照組比較(見圖7)，MAP2表達(dá)陽性率EPO≥5u/ml各實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

*與對(duì)照組相比P<0.05

圖7 EPO各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較神經(jīng)元表達(dá)陽性率

3 討論

NSCs是當(dāng)今科學(xué)研究熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)分離胚胎大鼠腦皮質(zhì)，經(jīng)處理吹打成單細(xì)胞，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基對(duì)其懸浮培養(yǎng)，可獲得懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)球，電鏡結(jié)果顯示，神經(jīng)球內(nèi)細(xì)胞核質(zhì)比例較高，細(xì)胞器較少，此結(jié)果與一般干細(xì)胞形態(tài)特征相一致。nestin具有維持神經(jīng)前體細(xì)胞正常形態(tài)的作用，在本實(shí)驗(yàn)將nestin作為NSCs的標(biāo)記物，神經(jīng)球爬片6～8h，其免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示球內(nèi)細(xì)胞均呈nestin陽性，表明生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為NSCs，且具增殖潛能。在添加10%FBS的培養(yǎng)基中NSCs貼壁，7d后行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，示分化細(xì)胞中部分表達(dá)MAP2陽性或GFAP陽性，表明本實(shí)驗(yàn)源于SD大鼠胚胎腦皮質(zhì)的細(xì)胞體外培養(yǎng)，具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞的能力。

EPO為促紅細(xì)胞生成素，在體內(nèi)對(duì)NSCs的保護(hù)作用研究較多[4-5]，Yu等[4]的研究表明,在腦及脊髓EPO和其受體有抗細(xì)胞凋亡功能，對(duì)神經(jīng)元正常發(fā)育有重要作用。體外培養(yǎng)可以研究單因素對(duì)NSCs的影響，本實(shí)驗(yàn)取材位置是SD大鼠胚胎腦皮質(zhì)，前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[2]表明EPO在適當(dāng)濃度下可抑制體外培養(yǎng)的NSCs凋亡。本實(shí)驗(yàn)NSCs爬片分化7d，MAP2免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示EPO≥5 u/ml各實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞表達(dá)率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，表明適當(dāng)劑量的EPO促進(jìn)體外大鼠胚胎腦皮質(zhì)NSCs向神經(jīng)元方向分化。在體內(nèi)促紅細(xì)胞生成素EPO與促紅細(xì)胞生成素受體(EPO-R)結(jié)合，激活蛋白酪氨酸激酶，在細(xì)胞內(nèi)快速誘導(dǎo)多種蛋白質(zhì)發(fā)生酪氨酸磷酸化，從而啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如Ras有絲分裂原激活蛋白激酶等將信號(hào)傳到細(xì)胞核核因子1，控制NSCs增殖、分化。腦內(nèi)皮細(xì)胞在促紅細(xì)胞生成素直接作用下分泌腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，后者通過作用于鄰近細(xì)胞的旁分泌方式促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生[6-9]。在體外EPO促進(jìn)源于胚胎腦皮質(zhì)的NSCs分化，推測(cè)可能原因：一方面，源于大鼠胚胎腦皮質(zhì)的NSCs有與促紅細(xì)胞生成素相結(jié)合的受體，體外培養(yǎng)基中加入EPO，EPO便與腦皮質(zhì)NSCs上的EPO-R結(jié)合啟動(dòng)了信號(hào)傳導(dǎo)通路而促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向的分化，另一方面可能刺激了源于胚胎腦皮質(zhì)的NSCs分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子，此因子作用于鄰近神經(jīng)干細(xì)胞，從而促進(jìn)了NSCs向神經(jīng)元方向的分化。NSCs向神經(jīng)元方向分化的具體調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚，受自身基因和外來信號(hào)等方面共同調(diào)節(jié)，下一步將繼續(xù)深入探討胚胎NSCs向神經(jīng)元定向誘導(dǎo)分化的影響因素及其分化機(jī)制，為NSCs移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及神經(jīng)變性性疾病提供理論基礎(chǔ)。

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