李 軍 辛 勤 林麗文

(濟寧醫(yī)學院基礎學院，山東 濟寧 272067)

老年性癡呆，即阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)多發(fā)在老年，以近期記憶障礙為主要臨床癥狀，以神經(jīng)元纖維纏結、大量記憶性神經(jīng)元丟失以及β-淀粉樣蛋白沉積為主要病理改變的進行性神經(jīng)變性疾病，目前仍無良好的防治藥物[1-2]。綠茶是一種非發(fā)酵茶，其主要活性成分是綠茶多酚(green tea polyphenols，GTPs)[3]。GTPs是綠茶中酚類物質(zhì)的總稱，其中兒茶素類含量最多，近年研究發(fā)現(xiàn)GTPs具有抗氧化、 減輕自由基損傷、抗衰老、抗炎、抗菌、抗癌等多種藥理作用[4]。本實驗以東莨菪堿和D-半乳糖建立記憶障礙小鼠模型，觀察GTPs對小鼠學習記憶功能的影響，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 昆明種小鼠，雄性，體重(20±2.0)g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物中心提供。

1.1.2藥物與試劑 GTPs(鄭州荔諾生物科技有限公司，批號：CDF20120302);吡拉西坦(吉林雙藥藥業(yè)集團有限公司，批號：20111001);氫溴酸東莨菪堿(上海禾豐制藥有限公司，批號：110402);生理鹽水(石家莊四藥有限公司，批號：110824405);D-半乳糖(上海源聚生物科技有限公司，批號：101201)。

1.1.3主要儀器設備 小鼠自主活動測試儀(成都泰盟科技有限公司，ZZ-6型)；小鼠跳臺測試儀(成都泰盟科技有限公司，DT-200型)；程控水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物研究所，SMG-2型)。

1.2 實驗方法

1.2.1動物分組與給藥 首先將小鼠在實驗室飼養(yǎng)7d以適應環(huán)境，然后進行預選，即將小鼠放入跳臺裝置，加以24V電壓，將過度敏感(通電立刻出現(xiàn)電驚厥)小鼠和極不敏感(不表現(xiàn)逃避電擊反應)小鼠淘汰，篩選出60只合格小鼠。隨機分為6組(每組10只)：1)正常對照組；2)模型組；3)陽性對照組(吡拉西坦)；4)GTPs低劑量組；5)GTPs中劑量組；6)GTPs高劑量組。各組均按0.1ml/10g體重灌胃給藥，每日1次。1)、2)組灌胃0.9%生理鹽水；3)組灌胃吡拉西坦600mg/kg；4)組灌胃GTPs 100mg/kg；5)組灌胃GTPs 250mg/kg；6)組灌胃GTPs 625mg/kg[5]。

1.2.2東莨菪堿致小鼠記憶獲得障礙實驗 按上述方法分組并連續(xù)給藥14d，末次灌胃給藥后2h，除1)組灌胃等容積的生理鹽水外，2)～6)組分別按2mg/kg腹腔注射東莨菪堿(造模)，注射后30min，進行跳臺實驗訓練，24h后進行測試。第17天開始進行水迷宮行為實驗，第17至第19天訓練，第20天測試且數(shù)據(jù)作為記憶成績。

1.2.3D-半乳糖致小鼠學習記憶障礙實驗 按上述方法分組，除1)組外；2)～ 6)組每日頸背部皮下注射140mg/kg·d D-半乳糖，連續(xù)6周，造成學習記憶障礙的模型小鼠。同時，1)組和2)組灌胃等體積生理鹽水，其余4組灌胃相應藥物，給藥體積均為0.1ml/10g，連續(xù)42d。末次給藥后1h進行跳臺訓練，第43天進行測試且數(shù)據(jù)作為記憶成績。第45至第47天進行水迷宮訓練，第48天測試且數(shù)據(jù)作為記憶成績。

1.2.4跳臺實驗(step-down test)[6]實驗時先將小鼠放入跳臺箱中適應環(huán)境3min，隨后將其放在安全平臺上并通以24V交流電，如小鼠跳下平臺，正常反應是跳回平臺以躲避傷害性刺激。但多數(shù)動物可能再次或多次跳下平臺，受到電擊后又跳回平臺。以小鼠跳下平臺雙足接觸銅柵記為錯誤次數(shù)，如此訓練5min。24h后進行測試，直接將小鼠放在安全平臺上并通電，記錄5min內(nèi)小鼠首次跳下平臺的時間(即潛伏期)和跳下平臺受電擊的次數(shù)(即錯誤次數(shù))，作為記憶成績。測試時若小鼠停留在平臺上超過5min，則其潛伏期記為300s。

1.2.5水迷宮實驗(water maze test)[7]實驗開始后將小鼠頭朝迷宮壁放在起點，記錄小鼠從起點游至終點的時間(潛伏期)及進入迷宮盲端的錯誤次數(shù)，3min內(nèi)游不出者潛伏期記為180s。若小鼠在規(guī)定時間內(nèi)不能游至臺階，則將其引導至臺階，并使其在終點停留20s。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。

2 結果

2.1 東莨菪堿致獲得記憶障礙小鼠跳臺實驗

與正常對照組相比，模型組小鼠在跳臺試驗中的錯誤次數(shù)增多(P<0.05)，潛伏期明顯縮短(P<0.01)。與模型組相比，GTPs中、高劑量組對東莨菪堿所致小鼠記憶獲得障礙有明顯改善作用，表現(xiàn)為5min內(nèi)錯誤次數(shù)減少(P<0.05)，潛伏期明顯延長(P<0.01)，而且與吡拉西坦組比較無差異。結果見表1

表1 GTPs對東莨菪堿致記憶獲得障礙小鼠跳臺成績的影響

注：與正常對照組比較，#P<0.05，# #P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 東莨菪堿致獲得記憶障礙小鼠水迷宮實驗

與正常對照組相比，模型組小鼠進入盲端次數(shù)(即錯誤次數(shù))明顯增多(P<0.01)，到達終點的時間(潛伏期)明顯延長(P<0.01)。綠茶多酚低、中、高劑量組均使小鼠的錯誤次數(shù)減少(P<0.05)，潛伏期縮短(P<0.05)。而且綠茶多酚各劑量組與吡拉西坦組之間無差異。結果見表2。

表2 GTPs對東莨菪堿造成記憶獲得障礙小鼠水迷宮實驗的影響

注：與正常對照組比較，#P<0.05，# #P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 D-半乳糖致學習記憶障礙小鼠跳臺實驗

與正常對照組相比，模型組小鼠首次錯誤的潛伏期明顯縮短(P<0.01)，錯誤次數(shù)增加(P<0.05)。GTPs低、中、高劑量組小鼠的錯誤次數(shù)較模型組減少(P<0.05)，潛伏期較模型組明顯延長(P<0.01)。而且與吡拉西坦組比較無差異。結果見表3。

表3 GTPs對D-半乳糖致記憶獲得障礙小鼠跳臺實驗成績的影響

注：與正常對照組比較，#P<0.05，# #P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 D-半乳糖致學習記憶障礙小鼠水迷宮實驗

與正常對照組相比，模型組小鼠進入迷宮盲端的錯誤次數(shù)增多(P<0.05)，到達終點的潛伏期明顯延長(P<0.01)。GTPs低、中、高劑量組小鼠的錯誤次數(shù)較模型組減少(P<0.05)，潛伏期較模型組明顯縮短(P<0.01)。而且與吡拉西坦組比較無差異。結果見表4。

表4 GTPs對D-半乳糖致記憶獲得障礙小鼠水迷宮實驗的影響

注：與正常對照組比較，#P<0.05，# #P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

學習、記憶和思維是大腦的高級活動，記憶障礙AD的重要癥狀?，F(xiàn)代研究認為，中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)與學習記憶密切相關，乙酰膽堿(Ach)為腦內(nèi)促進學習記憶的重要神經(jīng)遞質(zhì)，東莨菪堿是中樞M型膽堿受體拮抗劑，能特異性阻滯信息由第一級記憶向第二級記憶的轉移過程，干擾獲得近期記憶的能力，從而造成記憶獲得障礙。現(xiàn)已廣泛用于動物實驗中建立認知功能損傷的動物模型。本研究給小鼠一次腹腔注射東莨菪堿2mg/kg，造成小鼠記憶獲得障礙。

本研究還采用了長期頸部皮下注射D-半乳糖的方法建立具有記憶功能障礙的小鼠模型。在一定時間內(nèi)連續(xù)給小鼠注射D-半乳糖，機體細胞內(nèi)半乳糖濃度逐漸升高，在醛糖還原酶催化下還原成半乳糖醇，半乳糖醇這種代謝終產(chǎn)物不能進一步代謝而堆積在細胞內(nèi)，導致細胞腫脹、功能障礙及全身代謝紊亂，最終導致機體衰老，這一過程與機體的自然衰老過程相似[8]，同時大量的D-半乳糖在半乳糖氧化酶的作用可產(chǎn)生過量的超氧陰離子自由基(O2-)，與核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子反應，損壞機體的功能，加重對細胞的損傷，短期內(nèi)可引起小鼠衰老甚至死亡[9]。D-半乳糖致小鼠衰老模型是目前國內(nèi)應用最多的衰老模型。

藥物對學習記憶的影響，主要是通過行為學的方法來觀察，本文采用了2種不同的行為學測定實驗來反映衰老過程中小鼠學習記憶能力的變化，其中跳臺法反映小鼠的被動回避能力，水迷宮法反映小鼠的空間學習記憶能力；這2個行為學指標均可客觀地反映出各組小鼠的學習記憶能力情況。

本文結果表明，腹腔注射東莨菪堿的小鼠出現(xiàn)了明顯的記憶障礙，GTPs 中、高劑量能明顯改善小鼠在跳臺實驗中的記憶再現(xiàn)缺失，使小鼠的跳臺錯誤次數(shù)減少，潛伏期明顯延長；GTPs各劑量組能拮抗小鼠在水迷宮實驗中的空間定向學習記憶障礙，表現(xiàn)為從起點到達終點平臺的潛伏期縮短，進入盲端的錯誤次數(shù)減少，明顯提高學習的記憶能力。本文結果還表明，D-半乳糖模型組小鼠也出現(xiàn)了明顯的記憶障礙，GTPs各劑量組可明顯改善D-半乳糖引起的小鼠記憶減退，且具有一定的劑量依賴性。

綜上所述，本文采用2種比較成熟的實驗動物模型，采用2種行為學實驗方法，證明GTPs能較好改善記憶獲得障礙模型小鼠的記憶功能。GTPs對學習記憶障礙的改善作用可能與其抗氧化、增強對自由基的清除、保護腦神經(jīng)細胞免受自由基的損害作用有關，其具體作用機理正在研究中。

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