徐蓬軍，宋鵬飛，任廣偉

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002）

煙草重要基因篇：6. 煙草抗蟲(chóng)相關(guān)基因

徐蓬軍1，宋鵬飛2，任廣偉1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002）

植物與植食性昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中形成了復(fù)雜的互作關(guān)系：昆蟲(chóng)通過(guò)植物的生理和化學(xué)信號(hào)尋找寄主、取食和產(chǎn)卵，植物自身為抵抗昆蟲(chóng)的為害相應(yīng)地形成了多種防御體系，包括生理防御（通過(guò)長(zhǎng)刺、延長(zhǎng)表皮毛和加厚表皮等）和化學(xué)防御（利用次生代謝物）[1]。近年來(lái)，因化學(xué)農(nóng)藥用于害蟲(chóng)防治帶來(lái)的諸多環(huán)境安全問(wèn)題，以植物次生代謝物為主的化學(xué)防御引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注[1]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)研究上述防御機(jī)制，人們獲得了多種植物源的抗蟲(chóng)基因，并逐步用于害蟲(chóng)防治[2]。煙草是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，由于病蟲(chóng)害的大量發(fā)生，化學(xué)農(nóng)藥的使用量不斷上升，這在一定程度上控制住了蟲(chóng)害的發(fā)生，但長(zhǎng)期大量使用農(nóng)藥帶來(lái)了一系列問(wèn)題，例如農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等，因此挖掘抗蟲(chóng)基因防治煙草害蟲(chóng)成為害蟲(chóng)防治的一種重要手段。多年來(lái)，研究者已證明煙草可產(chǎn)生一系列相關(guān)化學(xué)物質(zhì)而具有一定的抗蟲(chóng)性[3-7]。但在煙草抗蟲(chóng)基因方面的研究還較少，主要集中在蛋白酶抑制劑基因、防御物質(zhì)合成基因和信號(hào)途徑基因等方面。

1 蛋白酶抑制劑基因

植物蛋白酶抑制劑（proteinase inhibitor, PI）是一類(lèi)能抑制蛋白酶活性的小分子蛋白或多肽，在植物防御病蟲(chóng)害為害中起到重要的作用。昆蟲(chóng)取食后，蛋白酶抑制劑可與昆蟲(chóng)的蛋白水解酶相結(jié)合，抑制昆蟲(chóng)對(duì)蛋白質(zhì)的消化和吸收，另一方面會(huì)引起昆蟲(chóng)蛋白酶的過(guò)量合成和分泌，干擾昆蟲(chóng)的正常代謝。在煙草中目前只開(kāi)展了胰蛋白酶抑制劑和糜蛋白酶抑制劑部分研究，證明蛋白酶抑制劑跟煙草的抗蟲(chóng)性密切相關(guān)[8-9]。

2 防御物質(zhì)合成的相關(guān)基因

2.1 氧化酶

活性氧的快速產(chǎn)生是植物應(yīng)對(duì)病蟲(chóng)害防衛(wèi)反應(yīng)的重要標(biāo)志，在逆境脅迫下，植物體會(huì)通過(guò)氧化酶積累大量的活性氧、陰離子過(guò)氧化物等，將組織中的相關(guān)成分氧化成毒性物質(zhì)[10]。煙草中的氧化酶同源基因Narboh D 的表達(dá)跟煙草體內(nèi)活性氧的含量成正比[11]。

2.2 過(guò)氧化物酶

在植物體內(nèi)，過(guò)氧化物酶在 H2O2的幫助下能催化單酚、二酚及芳香胺反應(yīng)生成對(duì)生物具有高度毒性的醌，從而起到抗病蟲(chóng)害的效果，植物在受到外力損傷的時(shí)候也相應(yīng)地提高過(guò)氧化物酶基因的表達(dá)水平[12]。對(duì)煙草不同抗蟲(chóng)品種的研究表明，抗蟲(chóng)性越高其過(guò)氧化物酶及其同工酶的表達(dá)量及活性也越高[13-14]。

2.3 細(xì)胞色素氧化酶 P450

細(xì)胞色素氧化酶 P450 調(diào)節(jié)植物次生代謝合成中的許多反應(yīng)，包括生物堿、脂肪酸的前體及苯基異丙酮和植物毒素等。植物遇到蟲(chóng)害時(shí)，受害組織及其鄰近部位將提高 P450 的表達(dá)量和活性，改變代謝過(guò)程，從而合成更多的上述次生物質(zhì)，使植物產(chǎn)生抗蟲(chóng)性。煙草研究中表明，抑制細(xì)胞色素氧化酶 P450 水解酶基因的表達(dá)可顯著提高煙草對(duì)煙蚜的抗性[15]。

2.4 谷氨酸脫羧酶

γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyrate，GABA）是一種四碳非蛋白氨基酸，可通過(guò) GABA 介導(dǎo)的氯離子通道阻止無(wú)脊椎動(dòng)物的神經(jīng)傳遞。受損植物可通過(guò)快速積累 GABA，從而對(duì)害蟲(chóng)起到暫時(shí)的麻痹作用，達(dá)到抗蟲(chóng)的效果[16]。GABA 由谷氨酸脫羧酶合成，蟲(chóng)害可迅速誘導(dǎo)煙草谷氨酸脫羧酶基因的表達(dá)上調(diào)，從而增加 GABA 的含量[17-18]。

3 茉莉酸信號(hào)途徑

茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑是指植物以茉莉酸（jasmonic acid，JA）和茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）介導(dǎo)的防御系統(tǒng)[19]。植物被昆蟲(chóng)為害后，通過(guò)茉莉酸信號(hào)途徑誘導(dǎo)合成具有毒殺作用的植物次生代謝物質(zhì)，茉莉酸本身不具有殺蟲(chóng)作用。茉莉酸信號(hào)途徑是目前煙草中研究最為詳細(xì)的植物防御系統(tǒng)，包括茉莉酸合成的上游調(diào)控基因、小分子物質(zhì)以及主要合成酶等[20-25]。Wang 等[19]以煙草為模式生物，詳細(xì)敘述了茉莉酸生物合成途徑。昆蟲(chóng)取食煙草時(shí)，其分泌物中的脂肪酸氨基酸合物(FACs)進(jìn)入植物組織誘導(dǎo)植物激活水楊酸誘導(dǎo)蛋白激酶（SIPK）和損傷誘導(dǎo)蛋白激酶（WIPK），在這兩種蛋白激酶的共同作用下激活茉莉酸的合成：葉綠體內(nèi)首先在質(zhì)體甘油脂酶 A1（GLA1）的作用下生成 α-亞麻酸，α-亞麻酸在脂氧合酶（LOX3）、丙二烯合成酶（AOS）和丙二烯氧化環(huán)化酶（AOC）的共同催化作用下生成穩(wěn)定的中間體 12-氧-二烯酸（OPDA），OPDA 隨后轉(zhuǎn)變?yōu)檫^(guò)氧物酶體，在 OPDA 還原酶（OPR3）和三步氧化還原反映下轉(zhuǎn)化為茉莉酸。植物茉莉酸合成受 SIPK 激酶、WIPK 激酶、NPR1 非表達(dá)因子、BAK1 受體激酶、谷胱甘肽還原酶(GSNOR)和 SKP1 等位基因抑制子(SGT1)的正調(diào)控，受 MPK4、CDPK4、CDPK5 激酶和 NOA1 蛋白的負(fù)調(diào)控。茉莉酸進(jìn)一步在茉莉酸抗性 1(JAR)的作用下生成茉莉酸異亮氨酸，在茉莉酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶(JMT)作用下生成茉莉酸甲酯、順式茉莉酸和 12-羥基茉莉酸。茉莉酸異亮氨酸結(jié)合泛素連接酶 SCFCOI1 起始茉莉酸途徑負(fù)調(diào)控子的 JAZ 蛋白的降解。在無(wú)茉莉酸的條件下，JAZ 蛋白可與茉莉酸信號(hào)途徑的正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子MYC2 相互作用。在內(nèi)外信號(hào)的作用下，茉莉酸異亮氨酸合成后特異性與 COI1 結(jié)合，促進(jìn) COI1 和 JAZ蛋白的生理互作，導(dǎo)致 JAZ 蛋白在 26S 蛋白酶體的作用下降解，從而激活 MYC2 轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)尼古丁、蛋白酶抑制劑和 17-羥基四烯醇二萜糖苷等防御化合物的產(chǎn)生。

4 問(wèn)題與展望

發(fā)展環(huán)境友好型的害蟲(chóng)治理方法已成為現(xiàn)代植物保護(hù)研究的焦點(diǎn)，植物源抗蟲(chóng)基因的開(kāi)發(fā)和利用無(wú)疑是達(dá)到此目的的重要手段之一。目前，煙草抗蟲(chóng)基因的研究相對(duì)落后，例如生物堿等重要的抗蟲(chóng)基因未見(jiàn)相關(guān)研究，但是煙草全基因組測(cè)序的完成為挖掘煙草抗蟲(chóng)基因奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)?；诖耍靡韵聝煞N方法可快速地篩選煙草抗蟲(chóng)基因進(jìn)行理論和應(yīng)用研究：（1）根據(jù)其他作物中已報(bào)道的抗蟲(chóng)基因，篩選煙草同源基因，進(jìn)行抗蟲(chóng)性研究；（2）通過(guò)研究害蟲(chóng)與煙草的互作關(guān)系，獲得抗蟲(chóng)性材料，利用現(xiàn)代分子生物方法，例如芯片、RNA-seq 技術(shù)等[26]，分析獲得煙草抗蟲(chóng)基因，并進(jìn)行后續(xù)的理論和應(yīng)用研究。隨著煙草抗蟲(chóng)基因的深入研究，必將產(chǎn)生病蟲(chóng)害防治的新方法用于煙草的安全生產(chǎn)。

[1]Wu J, Baldwin I T. New insights into plant responses to the attack from insect herbivores[J]. Annu Rev Genet, 2010, 44: 1-24.

[2]Hilder V A, Barker R F, Samour R A, et al. Protein and cDNA sequences of Bowman-Birk protease inhibitors from the cowpea (Vigna unguiculata Walp.)[J]. Plant Mol Biol, 1989, 13: 701-710.

[3]Johnson A W, Severson R F, Hudson J, et al. Tobacco leaf trichomes and their exudates[J]. Tobacco Sci, 1985, 29: 67-72.

[4]Severson R F, Johnson A W, Jachson D M. Cuticular constituents of tobacco: factors affecting their production and their role in insect and disease resistance and smoke quality[J]. Recent Adv Tobacco Sci, 1985, 11: 105-174.

[5]Thurston R, Webster J A. Toxicity of Nicotian agossei domin to Myzuspersicae (Sulzer) [J]. Entomol Exp Appl, 1962, 5: 233-238.

[6]Dixit S, Upadhyay S K, Singh H, et al. Enhanced methanol production in plants provides broad spectrum insect resistance[J]. PLoS One, 2013, 8: e79664.

[7]高熹，潘賢麗. 煙草抗蟲(chóng)性研究進(jìn)展[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004, 24(6): 59-67.

[8]Anderson M A, Van Heeswijck R, West J, et al. Proteinase inhibitors from Nicotiana alata enhance plant resistance to insect pests[J]. J Insect Physiol, 1997, 43: 833-842.

[9]Senthilkumar R, Cheng C P, Yeh K W. Genetically pyramiding protease-inhibitor genes for dual broad-spectrum resistance against insect and phytopathogens in transgenic tobacco[J]. Plant Biotechnol J, 2010, 8: 65-75.

[10]Sagi M, Davydov O, Orazova S, et al. Plant respiratory burst oxidase homologs impinge on wound responsiveness and development in Lycopersicon esculentum[J]. Plant Cell, 2004, 16: 616-628.

[11]Wu J, Wang L, Wunsche H, et al. Narboh D, a respiratory burst oxidase homolog in Nicotiana attenuata, is required for late defense responses after herbivore attack[J]. J Integr Plant Biol, 2013, 55: 187-198.

[12]Hiraga S, Ito H, Sasaki K, et al. Wound-induced expression of a tobacco peroxidase is not enhanced by ethephon and suppressed by methyl jasmonate and coronatine[J]. Plant Cell Physiology, 2000, 41: 165-170.

[13]Dowd P F, Holmes R A, Pinkerton T S, et al. Relative activity of a tobacco hybrid expressing high levels of a tobacco anionic peroxidase and maize ribosome-inactivating protein against Helicoverpa zea and Lasioderma serricorne[J]. J Agric Food Chem, 2006, 54: 2629-2634.

[14]Dowd P F, Lagrimini L M, Nelsen T C. Relative resistance of transgenic tomato tissues expressing high levels of tobacco anionic peroxidase to different insect species[J]. Nat Toxins, 1998, 6: 241-249.

[15]Wang, E, Wang R, DeParasis J, et al. Suppression of a P450 hydroxylase gene in plant trichome glands enhances natural-product-based aphid resistance[J]. Nat Biotechnol, 2001, 19: 371-374.

[16]Bermudez I, Hawkins C A, Taylor A M, et al. Actions of insecticides on the insect GABA receptor complex[J]. J Recept Res, 1991, 11: 221-232.

[17]Bown A W, Hall D E, MacGregor K B. Insect footsteps on leaves stimulate the accumulation of 4-aminobutyrate and can be visualized through increased chlorophyll fluorescence and superoxide production[J]. Plant Physiol, 2002, 129: 1430-1434.

[18]MacGregor K B, Shelp B J, Peiris S et al. Overexpression of glutamate decarboxylase in transgenic tobacco plants deters feeding by phytophagous insect larvae[J]. J Chem Ecol, 2003, 29: 2177-2182.

[19]Wang L, Wu J. The essential role of jasmonic acid in plant-herbivore interactions--using the wild tobacco Nicotiana attenuata as a model[J]. J Genet Genomics, 2013, 40: 597-606.

[20]Gaquerel E, Steppuhn A, Baldwin I T. Nicotiana attenuata alpha-DIOXYGENASE1 through its production of 2-hydroxylinolenic acid is required for intact plant defense expression against attack from Manduca sexta larvae[J]. New Phytol, 2012, 196: 574-585.

[21]Hettenhausen C, Baldwin I T, Wu J. Nicotiana attenuata MPK4 suppresses a novel jasmonic acid (JA) signaling-independent defense pathway against the specialist insect Manduca sexta, but is not required for the resistance to the generalist Spodoptera littoralis[J]. New Phytol, 2013,199: 787-799.

[22]Woldemariam M G, Dinh S T, Oh Y, et al. NaMYC2 transcription factor regulates a subset of plant defense responses in Nicotiana attenuata[J]. BMC Plant Biol, 2013, 13: 73.

[23]Wunsche H, Baldwin I T, Wu J. S-Nitrosoglutathione reductase (GSNOR) mediates the biosynthesis of jasmonic acid and ethylene induced by feeding of the insect herbivore Manduca sexta and is important for jasmonate-elicited responses in Nicotiana attenuata[J]. J Exp Bot, 2011, 62: 4605-4616.

[24]Yang D H, Hettenhausen C, Baldwin I T, et al. Silencing Nicotiana attenuata calcium-dependent protein kinases, CDPK4 and CDPK5, strongly up-regulates wound- and herbivory-induced jasmonic acid accumulations[J]. Plant Physiol, 2012, 159: 1591-1607.

[25]Ziegler J, Keinanen M, Baldwin I T. Herbivore-induced allene oxide synthase transcripts and jasmonic acid in Nicotiana attenuata[J]. Phytochemistry, 2001, 58: 729-738.

[26]Wu Y J, Wu Y J, Luo X, et al. Identification of differentially expressed genes that potentially confer pest resistance in transgenic ChIFN-gamma tobacco[J]. Gene, 2014, 543: 181-189.