李樹海 田輝 岳韋名 李林 高存 司立博 胡文思 亓磊 魯銘 崔京京 陳觀卿

食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell cancer，ESCC)是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1]。由于疾病進(jìn)展、局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、化療抵抗等因素，ESCC患者的總體5年生存率仍未得到根本性提高，為10%～40%[2-3]。臨床上，患者預(yù)后判定和治療策略的制定主要是根據(jù)疾病的病理分期，但即使術(shù)后處于同一病理分期的患者，其預(yù)后也往往存在著較明顯的差異，因此，僅僅依據(jù)病理分期來(lái)預(yù)測(cè)患者的預(yù)后并制定相應(yīng)治療措施的針對(duì)性較差[4-5]。隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的不斷進(jìn)展，ESCC的分子預(yù)后研究愈加受到重視，發(fā)現(xiàn)能夠有效預(yù)測(cè)ESCC進(jìn)展及患者預(yù)后的新分子標(biāo)志物，結(jié)合傳統(tǒng)病理分期對(duì)術(shù)后高?；颊哌M(jìn)行篩選，優(yōu)化ESCC患者的個(gè)體化治療，是ESCC治療的方向之一[6]。

MicroRNA(miRNA)近年來(lái)成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的明星分子，是僅有19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA[7-9]。已有的研究表明：異常表達(dá)的miRNA廣泛參與人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥等演進(jìn)過程[10-12]。miR-148a作為miRNA家族中的一員，是一種高度保守的miRNA，其前體序列定位于人類7號(hào)染色體短臂的1區(qū)5帶[13]。miR-148a主要發(fā)揮抑癌基因樣作用，抑制惡性腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性表型，越來(lái)越受到研究者的重視[14-17]。miR-148a在人類多種惡性腫瘤組織中表達(dá)降低，然而，有關(guān)ESCC組織中miR-148a的表達(dá)及其與患者臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性，目前國(guó)內(nèi)尚未見相關(guān)的研究報(bào)道。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)法檢測(cè)ESCC組織中miR-148a的表達(dá)水平，并結(jié)合患者的臨床病理資料和術(shù)后隨訪資料進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析，研究miR-148a表達(dá)與患者臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性，探討miR-148a在ESCC進(jìn)展及預(yù)后判定中的作用和臨床意義。

資料與方法

一、 臨床資料

本研究選取2009年1至12月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院胸外科行食管癌手術(shù)治療的患者，患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)行食管癌切除、胃食管吻合及系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃術(shù)[18]；(2)術(shù)前的相關(guān)輔助檢查未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶；(3)臨床病理資料及隨訪資料均完整；(4)術(shù)前未接受放療或化療?；颊吲懦龢?biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前行放療或化療；②隨訪資料不完整；③圍手術(shù)期死亡；④行姑息性切除。共有75例患者符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)，其中男性56例，女性19例；年齡39～75歲。

ESCC的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照世界衛(wèi)生組織2000年的消化道腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)[19]，術(shù)后病理分期參照國(guó)際抗癌聯(lián)盟2002年的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[20]。

二、 Real-time PCR法檢測(cè)miR-148a的表達(dá)

在八聯(lián)管中配制以下反應(yīng)體系(20 μl)：模板cDNA 2 μl、SYBR Green反應(yīng)液10 μl、去離子水6 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl。使用ABI7500 PCR反應(yīng)儀進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定miRNA的表達(dá)。miR-148a表達(dá)水平的檢測(cè)以U6作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-148a的相對(duì)表達(dá)量。相對(duì)表達(dá)量高于測(cè)定的平均值定義為miR-148a高表達(dá)；相對(duì)表達(dá)量低于測(cè)定的平均值定義為miR-148a低表達(dá)。

三、 隨訪

所有患者均順利出院，每隔3～6個(gè)月隨訪1次。隨訪內(nèi)容包括體格檢查、鋇餐、化驗(yàn)分析、CT、超聲以及必要時(shí)行胃鏡檢查等。記錄從手術(shù)之日起至患者死亡或隨訪截止日的時(shí)間，計(jì)算總生存率。本研究的隨訪截止時(shí)間為2012年12月，中位隨訪時(shí)間為38個(gè)月(8～47個(gè)月)。

四、 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將患者的臨床病理資料、隨訪資料及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)共同建立數(shù)據(jù)庫(kù)。χ2檢驗(yàn)比較miR-148a表達(dá)與患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系；Kaplan-Meier法繪制患者的生存曲線；Log-rank檢驗(yàn)比較患者的生存差別；Cox多因素回歸分析判定獨(dú)立的預(yù)后因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 miR-148a表達(dá)與患者臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

42.7%(32/75)的患者腫瘤組織中檢測(cè)到miR-148a低表達(dá)，χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示miR-148a低表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度(T120.0%、T228.0%、T357.5%，χ2=8.149，P=0.017)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N030.6%、N153.8%，χ2=4.151，P=0.042)和病理分期(Ⅰ期22.2%、Ⅱ期34.2%、Ⅲ期60.7%，χ2=6.474，P=0.039)顯著相關(guān)，而與患者的性別(χ2=0.230，P=0.632)、年齡(χ2=0.020，P=0.888)、腫瘤直徑(χ2=0.523，P=0.770)及腫瘤分化程度(χ2=0.461，P=0.794)均無(wú)顯著的相關(guān)性(表1)。

二、 單因素和多因素生存分析

75例患者術(shù)后3年的總生存率為70.7%(53/75)。單因素生存分析結(jié)果顯示：腫瘤浸潤(rùn)深度(T1100.0%、T292.0%和T350.0%，χ2=18.288，P<0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N091.7%和N151.3%，χ2=14.285，P<0.001)及miR-148a低表達(dá)(低表達(dá)53.1%和高表達(dá)83.7%，χ2=9.136，P=0.003)(圖1)均與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。Cox多因素回歸分析結(jié)果顯示：浸潤(rùn)深度(95%CI為1.015～2.799，P=0.044)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(95%CI為1.285～4.796，P=0.007)分別是判定患者術(shù)后3年總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素(表2)。

討 論

miR-148a作為一種重要的抑癌基因，通過對(duì)靶基因的調(diào)控來(lái)抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥等多種惡性表型，它在人類多種惡性腫瘤(結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌等)中的表達(dá)水平是下降的，并與腫瘤進(jìn)展及患者不良預(yù)后密切相關(guān)，已成為研究的熱點(diǎn)分子之一，有可能成為指導(dǎo)惡性腫瘤患者臨床個(gè)體化治療及預(yù)后判定的一個(gè)有效標(biāo)志物[13,17,21-26]。本研究首次檢測(cè)了ESCC組織中miR-148a的表達(dá)水平，并探討其與患者臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示：miR-148a在ESCC組織中存在異常低表達(dá)，并與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期顯著相關(guān)，提示miR-148a可能在ESCC的進(jìn)展過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。miR-148a表達(dá)的降低使ESCC細(xì)胞獲得更具侵襲性的表型，促進(jìn)ESCC的侵襲和進(jìn)展，miR-148a有可能成為潛在的抗ESCC進(jìn)展治療的新靶點(diǎn)。然而，惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，涉及多種基因、細(xì)胞，并受多因子不同層次的調(diào)控，miR-148a調(diào)控ESCC進(jìn)展的具體機(jī)制還需在分子水平上進(jìn)行更加深入的研究和探討。

生存分析結(jié)果顯示，miR-148a低表達(dá)患者的術(shù)后3年總生存率顯著低于miR-148a高表達(dá)患者，表明miR-148a有可能成為ESCC患者術(shù)后預(yù)后判定的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)。然而，Cox回歸多因素分析的結(jié)果卻顯示腫瘤浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分別是判定患者術(shù)后3年總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。本研究中可能由于納入的患者例數(shù)太少、隨訪時(shí)間過短及術(shù)后不同的輔助治療方案等，存在一定的偏倚，導(dǎo)致miR-148a在ESCC預(yù)后判定中的價(jià)值未得到客觀及充分的體現(xiàn)。

總之，本研究首次探討了ESCC組織中miR-148a表達(dá)與患者臨床病理指標(biāo)及預(yù)后之間的相關(guān)性，結(jié)果表明miR-148a在ESCC組織中存在異常低表達(dá)，并與腫瘤進(jìn)展及患者不良預(yù)后密切相關(guān)，提示miR-148a不僅可以作為一個(gè)判定ESCC進(jìn)展及患者預(yù)后的潛在參考指標(biāo)，并且有可能成為一個(gè)有效的抗ESCC治療的新靶點(diǎn)。

表2 食管癌患者術(shù)后單因素和多因素生存分析

1Sano A, Kato H, Sakurai S, et al. CD24 expression is a novel prognostic factor in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Ann Surg Oncol, 2009,16(2):506-514.

2Ren Y, Cao B, Law S, et al. Hepatocyte growth factor promotes cancer cell migration and angiogenic factors expression: a prognostic marker of human esophageal squamous cell carcinomas[J]. Clin Cancer Res, 2005,11(17):6190-6197.

3Mariette C, Balon JM, Piessen G, et al. Pattern of recurrence following complete resection of esophageal carcinoma and factors predictive of recurrent disease[J]. Cancer, 2003,97(7):1616-1623.

4Law S, Kwong DL, Kwok KF, et al. Improvement in treatment results and long-term survival of patients with esophageal cancer: impact of chemoradiation and change in treatment strategy[J]. Ann Surg, 2003,238(3):339-347.

5Okawa T, Naomoto Y, Nobuhisa T, et al. Heparanase is involved in angiogenesis in esophageal cancer through induction of cyclooxygenase-2[J]. Clin Cancer Res, 2005;11(22):7995-8005.

6Shih CH, Ozawa S, Ando N, et al. Vascular endothelial growth factor expression predicts outcome and lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the esophagus[J]. Clin Cancer Res, 2000;6(3):1161-1168.

7Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004,116(2):281-297.

8Lim LP, Lau NC, Garrett-Engele P, et al. Microarray analysis shows that some microRNAs down regulate large numbers of target mRNAs[J]. Nature, 2005,433(7027):769-773.

9Dykxhoorn DM. MicroRNAs and metastasis: little RNAs go a long way[J]. Cancer Res, 2010,70(16):6401-6406.

10 Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers[J]. Nat Rev Cancer, 2006,6(11):857-866.

11 Lovat F, Valeri N, Croce CM. Micro-RNAs in the pathogenesis of cancer[J]. Semin Oncol, 2011,38(6):724-733.

12 Chen PS, Su JL, Hung MC. Dysregulation of microRNAs in cancer[J]. J Biomed Sci, 2012,19:90.

13 賈筱琴,繆俊俊,雍軍,等.miR-148a對(duì)肝癌細(xì)胞株侵襲和遷移的抑制作用及機(jī)制[J].中國(guó)癌癥雜志,2014,24(6):412-417.

14 Chen Y, Song Y, Wang Z, et al. Altered expression of MiR-148a and MiR-152 in gastrointestinal cancers and its clinical significance[J]. J Gastrointest Surg, 2010,14(7):1170-1179.

15 Hummel R, Watson DI, Smith C, et al. Mir-148a improves response to chemotherapy in sensitive and resis-tant oesophageal adenocarcinoma and squamous cell carcinoma cells[J]. J Gastrointest Surg, 2011,15(3):429-438.

16 Zhang H, Li Y, Huang Q, et al. MiR-148a promotes apoptosis by targeting Bcl-2 in colorectal cancer[J]. Cell Death Differ, 2011,18(11):1702-1710.

17 Takahashi M, Cuatrecasas M, Balaguer F, et al. The clinical significance of MiR-148a as a predictive biomarker in patients with advanced colorectal cancer[J]. PLoS One, 2012,7(10):e46684.

18 Korst RJ, Rusch VW, Venkatraman E, et al. Proposed revision of the staging classification for esophageal cancer[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1998;115(3):660- 669.

19 Hamilton SR, Aaltonen LA. Tumours of the digestive system[M]//Pathology and Genetics, World Health Organization Classification of Tumours. Lyon :IARC Press, 2000:10-25.

20 Greene FL, Page DL, Fleming ID, et al. AJCC cancer staging handbook[M]. 6th ed. New York: Springer-Verlag, 2002:91-98.

21 Fujita Y, Kojima K, Ohhashi R, et al. MiR-148a attenuates paclitaxel resistance of hormone-refractory, drug-resistant prostate cancer PC3 cells by regulating MSK1 expression[J]. J Biol Chem, 2010,285(25):19076-19084.

22 Murata T, Takayama K, Katayama S, et al. miR-148a is an androgen-responsive microRNA that promotes LNCaP prostate cell growth by repressing its target CAND1 expression[J]. Prostate Cancer Prostatic Dis, 2010,13(4):356-361.

23 邱光庭,王遂函,李大鵬,等.微小RNA-148a對(duì)胃癌細(xì)胞MKN45增殖能力的影響及機(jī)制研究[J].中華胃腸外科雜志,2014,17(10):1036-1039.

24 Bofill-De Ros X, Gironella M, Fillat C. miR-148a- and miR-216a-regulated oncolytic adenoviruses targeting pancreatic tumors attenuate tissue damage without perturbation of miRNA activity[J]. Mol Ther, 2014,22(9):1665-1677.

25 Tao S, He H, Chen Q, et al. GPER mediated estradiol reduces miR-148a to promote HLA-G expression in breast cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014,451(1):74-78.

26 Zhou X, Zhao F, Wang ZN, et al. Altered expression of miR-152 and miR-148a in ovarian cancer is related to cell proliferation[J]. Oncol Rep, 2012,27(2):447-454.