趙歡，趙新達(dá)，岳宗豪，周一兵

(大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116023）

苯并(a）芘對(duì)雙齒圍沙蠶抗氧化酶活性和細(xì)胞色素P450基因表達(dá)的影響

趙歡，趙新達(dá)，岳宗豪，周一兵

(大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116023）

在實(shí)驗(yàn)室條件下，利用誘導(dǎo)試驗(yàn)分析了不同濃度苯并(a）芘［B(a）P］對(duì)雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis(體質(zhì)量為1.5 g±0.5 g）細(xì)胞色素P450基因表達(dá)和肌肉組織抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明:雙齒圍沙蠶細(xì)胞色素P450基因表達(dá)與B(a）P誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間呈正相關(guān)，隨著誘導(dǎo)濃度的增加和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐步上調(diào);超氧化物歧化酶 (SOD）、過(guò)氧化氫酶 (CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GPx）活性均隨B(a）P誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步升高，其中SOD酶活性隨B(a）P濃度的增加出現(xiàn)抑制，CAT和GPx酶活性則與B(a）P濃度呈正相關(guān)。

雙齒圍沙蠶;苯并(a）芘;細(xì)胞色素P450;抗氧化酶

多環(huán)芳烴 (PAHs）是一類(lèi)由兩個(gè)或兩個(gè)以上芳香環(huán)以線(xiàn)狀、角狀或簇狀排列構(gòu)成的碳?xì)浠衔?，是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的致癌類(lèi)化合物之一［1］。近年來(lái)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，廢物焚化以及工業(yè)廢氣廢水和生活污水的任意排放等產(chǎn)生了大量的PAHs污染物，它們通過(guò)降水和徑流進(jìn)入沿海水域，造成海洋PAHs污染［2］。已有調(diào)查表明，中國(guó)主要海域都存在不同程度的PAHs污染［3－4］。PAHs對(duì)海洋環(huán)境的影響已成為海洋環(huán)境保護(hù)的重要問(wèn)題，PAHs也成為海洋環(huán)境中優(yōu)先控制和必須檢測(cè)的污染物之一。

生物體通過(guò)體內(nèi)解毒酶活化代謝異生化學(xué)物質(zhì)是機(jī)體主要的適應(yīng)機(jī)制之一。已有研究表明，PAHs進(jìn)入生物體后會(huì)被CYP450依賴(lài)的混合功能氧化酶等氧化代謝，形成親水性中間產(chǎn)物，并產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)。這些中間代謝物會(huì)與以谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶為代表的內(nèi)源性分子結(jié)合轉(zhuǎn)化為低毒代謝產(chǎn)物排出體外，而形成的活性氧物質(zhì)則會(huì)被包括超氧化物歧化酶 (SOD）、過(guò)氧化氫酶 (CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GPx）等在內(nèi)的抗氧化防御酶所清除［5］。Wang 等［6］研究表明，褐菖鮋Sebatiscusmarmoratus的CYP1A蛋白含量，以及SOD和GST酶活性均隨著苯并(a）芘［B(a）P］暴露濃度的增加而增加;Holtha等［7］研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)Danio rerio的CYP1A基因表達(dá)可被 PAHs顯著誘導(dǎo);任加云等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在PAHs脅迫下，櫛孔扇貝Chlamys farreri的SOD、CAT、GPx酶活性呈現(xiàn)一定的時(shí)間劑量效應(yīng)。PAHs與機(jī)體解毒代謝酶之間的劑量效應(yīng)關(guān)系已在魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)等海洋生物中被大量報(bào)道，因此，生物體解毒代謝酶等生理生化指標(biāo)也成為海洋污染監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。

多毛類(lèi)隸屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)，廣泛棲居于污染物較為匯集的海陸交錯(cuò)帶沉積質(zhì)中，是具有典型沉積食性的底棲無(wú)脊椎動(dòng)物。多毛類(lèi)是許多大型海洋生物幼體的優(yōu)質(zhì)餌料，其豐度的大小會(huì)影響海洋生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)［9］。多毛類(lèi)對(duì)有毒污染物較為敏感，常被用作生態(tài)監(jiān)測(cè)的指示生物。近年來(lái)，國(guó)外學(xué)者陸續(xù)開(kāi)展了多毛類(lèi)外源污染物生物轉(zhuǎn)化的研究，發(fā)現(xiàn)混合功能氧化酶CYP450在多毛類(lèi)生物轉(zhuǎn)化代謝過(guò)程中起著重要作用。已有報(bào)道顯示［10－12］:歐洲沙蠶Nereis virens的 CYP342AI基因mRNA水平可被苯并(a）蒽等顯著誘導(dǎo);小頭蟲(chóng)Capitella capitata的CYP4AT1和CYP331A1基因表達(dá)可被PAHs顯著誘導(dǎo);多齒圍沙蠶Perinereis nuntia的CYP432A1、CYP431A1基因可被PAHs顯著誘導(dǎo)。在國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道尚不多見(jiàn)，本研究中，以廣泛分布的多毛類(lèi)雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis為研究對(duì)象，以B(a）P這一典型PAHs作為暴污物，研究了B(a）P暴露對(duì)雙齒圍沙蠶體內(nèi)主要抗氧化酶和解毒代謝相關(guān)因子CYP450的影響，探討了B(a）P對(duì)雙齒圍沙蠶的致毒機(jī)理，旨在為利用多毛類(lèi)進(jìn)行海洋環(huán)境污染監(jiān)測(cè)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用雙齒圍沙蠶于退潮期采自遼寧省葫蘆島海域，體質(zhì)量為 (1.5±0.5）g，將采集的個(gè)體放入塑料箱后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行暫養(yǎng)。暫養(yǎng)期間，每24 h更換一次海水，水溫為 (13±0.5）℃，鹽度為31～32，pH為8.25±0.10。

試驗(yàn)用分析純B(a）P購(gòu)于Sigma公司 (純度為99%）;分析純丙酮購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ均購(gòu)于TaKaRa公司;考馬斯亮蘭試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒和GSH－Px試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 B(a）P暴露試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［13］中的方法，設(shè)置兩個(gè)B(a）P濃度，分別為5、50 μg/L，另設(shè)一空白對(duì)照組和體積分?jǐn)?shù)為0.01%的丙酮溶劑對(duì)照組。挑取健康沙蠶個(gè)體，放入2 L預(yù)先加入500 mL不同濃度B(a）P毒液的塑料杯中，每個(gè)杯中放入8尾沙蠶，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)。每24 h更換一次新的溶液，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程不投喂飼料，試驗(yàn)期間，水溫維持在 (11±0.5）℃。于試驗(yàn)開(kāi)始后第4、7、14天分別從各處理組中隨機(jī)取8尾沙蠶，取體壁肌肉組織立即放入超低溫冰箱 (－80℃）中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CYP4基因表達(dá)的檢測(cè) 采用相對(duì)定量方法分析B(a）P暴露下雙齒圍沙蠶CYP4基因表達(dá)的規(guī)律，選取β－actin作為內(nèi)參基因。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的雙齒圍沙蠶CYP4和β－actin序列信息［14］，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息Tab.1 Sequences of primers used in this experiment

將沙蠶體壁研磨成粉末，利用RNAiso Plus試劑盒提取總RNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。取500 ng RNA，用PrimeScript RT reagent Kit gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系 (20 μL）:SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，引物 (10 μmol/L）各0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA 2 μL，滅菌雙蒸水6 μL。

PCR反應(yīng)條件:95℃下預(yù)變性30 s;95℃下變性5 s，60℃下退火30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)［15］。

1.2.3 組織勻漿的制備 取各處理組沙蠶體壁肌肉組織，加入一定量的生理鹽水，制成10%的組織勻漿，于4℃下以2000 r/min離心15 min，取上清液于冰箱 (－20℃）中保存，用于后續(xù)酶活性的檢測(cè)。

1.2.4 抗氧化酶活性的測(cè)定 各抗氧化酶指標(biāo)的測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶 (SOD）的活性，酶活力單位定義為:每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活力單位(U）。

采用分光光度計(jì)法測(cè)定過(guò)氧化氫酶 (CAT）的活性，酶活力單位定義為:每毫克組織蛋白每秒分解1 μmol H2O2為1個(gè)CAT活力單位 (U）。

采用雙硫代對(duì)硝苯甲酸 (DTNB）比色法測(cè)定谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GPx）的活性，酶活力單位定義為:每毫克蛋白質(zhì)每分鐘使反應(yīng)體系中還原型谷胱甘肽濃度降低1 μmol/L為1個(gè)GPx活力單位(U）。

采用考馬斯亮蘭法測(cè)定樣品蛋白含量，以牛血清白蛋白 (BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±S.D.）表示，利用SPSS 16軟件對(duì)同一取樣時(shí)間不同處理組進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 暴露于不同B(a）P濃度中的雙齒圍沙蠶CYP4基因表達(dá)的變化

從圖1可以看出，B(a）P脅迫到一定程度可以誘導(dǎo)沙蠶CYP4基因表達(dá)的升高，但是誘導(dǎo)趨勢(shì)并不顯著。暴露4 d時(shí)，各濃度組沙蠶CYP4基因表達(dá)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異 (P＞0.05）;暴露7 d時(shí)，50 μg/L B(a）P濃度組沙蠶CYP4基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào) (P＜0.05），而5 μg/L濃度組CYP4基因表達(dá)與對(duì)照組依然無(wú)明顯差異 (P＞0.05）;暴露14 d時(shí)，5、50 μg/L濃度組CYP4基因轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)升高。

注:*表示與對(duì)照組有顯著性差異 (P＜0.05）;＊＊表示與對(duì)照組有極顯著性差異 (P＜0.01），下同Note:* means significant difference compared with the control(P＜0.05）;＊＊ means very significant difference compared with the control(P＜0.01），et sequentia

2.2 暴露于不同B(a）P濃度中雙齒圍沙蠶SOD、CAT、GPx酶活性的變化

從圖2可以看出，溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組的3種抗氧化酶活性均無(wú)明顯差異 (P＞0.05），表明丙酮作為助溶劑對(duì)沙蠶沒(méi)有明顯的毒性效應(yīng)。在5 μg/L和50 μg/L B(a）P脅迫下，雙齒圍沙蠶SOD酶活性極顯著升高 (P＜0.01），并且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)酶活性逐漸升高。在5 μg/L B(a）P中暴露4、7、14 d時(shí)，SOD酶活力分別為對(duì)照組的1.6、1.91、2.61倍;而在50 μg/L B(a）P中暴露4、7、14 d時(shí)，SOD酶活力分別為對(duì)照組的1.32、1.47、1.84倍?？梢钥闯觯? μg/L B(a）P暴露組酶活性的升高趨勢(shì)較50 μg/L濃度組明顯。

從圖2可以看出，在5、50 μg/L濃度組中，CAT酶活性呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì) (P＜0.05），且CAT酶活性變化與暴露時(shí)間存在顯著的正相關(guān)。在5 μg/L B(a）P中暴露4、7、14 d時(shí)，CAT酶活性分別為對(duì)照組的1.10、1.33、1.54倍;在50 μg/L B(a）P中暴露4、7、14 d時(shí)，酶活性分別為對(duì)照組的1.59、1.76、2.13倍。這一變化趨勢(shì)與SOD酶活性的變化特征存在明顯差異。

與SOD和CAT酶活變化規(guī)律相比，B(a）P脅迫下雙齒圍沙蠶GPx酶活性的變化幅度最大。從圖2可見(jiàn)，沙蠶GPx酶活性隨著B(niǎo)(a）P濃度和暴露時(shí)間的增加呈極顯著的升高趨勢(shì) (P＜0.01）。B(a）P各濃度處理組沙蠶GPx酶活性在4 d時(shí)已極顯著高于對(duì)照組 (P＜0.01），隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活逐步升高。在5 μg/L和50 μg/L B(a）P脅迫下，雙齒圍沙蠶GPx酶活性在4 d時(shí)分別為對(duì)照組的3.34、4.61倍，在14 d時(shí)，GPx酶活力增加趨勢(shì)更加明顯，分別為對(duì)照組的4.64、5.70倍。

圖2B(a）P脅迫對(duì)雙齒圍沙蠶SOD、CAT、GPx酶活性的影響Fig.2 The effects of B(a）P on activities of SOD，CAT and GPx in sandworm Perinereis aibuhitensis

3 討論

3.1 B(a）P對(duì)雙齒圍沙蠶CYP450基因表達(dá)的影響

Jorgensen等［16］指出，多環(huán)芳烴在多毛類(lèi)體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程類(lèi)似于脊椎動(dòng)物，亦包括細(xì)胞色素P450酶的氧化代謝和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的解毒代謝兩個(gè)階段。本研究中，雙齒圍沙蠶CYP4基因的表達(dá)隨著B(niǎo)(a）P暴露時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表明B(a）P可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)雙齒圍沙蠶CYP4的表達(dá)，但CYP4基因上升趨勢(shì)并不顯著，暴露14 d時(shí)50 μg/L B(a）P濃度組沙蠶的CYP4基因轉(zhuǎn)錄水平僅為對(duì)照組的4.2倍。王振［17］在研究多齒圍沙蠶對(duì)B(a）P毒性響應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，CYP4A在2.5 μg/L B(a）P誘導(dǎo)下表達(dá)量為對(duì)照組的 1203倍，而在 50 μg/L B(a）P誘導(dǎo)下CYP4A表達(dá)量與對(duì)照組相近，而CYP4B則無(wú)明顯變化。在前期試驗(yàn)中，作者對(duì)獲得的雙齒圍沙蠶CYP4基因進(jìn)行了同源性比對(duì)［14］，確定獲得的CYP4基因?qū)儆贑YP4B亞家族。本試驗(yàn)中CYP4基因表達(dá)與王振［17］的研究結(jié)果有差異，這可能與不同多毛類(lèi)對(duì)多環(huán)芳烴生物轉(zhuǎn)化能力的差別有關(guān)。Rust等［18］比較了6種不同多毛類(lèi)對(duì)苯并芘的生物轉(zhuǎn)化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6種不同多毛類(lèi)生物轉(zhuǎn)化效率存在從92%～6%的較大差異性。另外，相比于脊椎動(dòng)物和昆蟲(chóng)CYP家族基因在毒性誘導(dǎo)作用下的高表達(dá)水平，雙齒圍沙蠶CYP4基因表達(dá)的誘導(dǎo)程度較低，這一現(xiàn)象與Li等［11］在Capitella capitata中獲得的結(jié)果相近，這種低誘導(dǎo)水平的表達(dá)可能與多毛類(lèi)CYP酶表達(dá)的低調(diào)控能力有關(guān)。

3.2 B(a）P對(duì)雙齒圍沙蠶抗氧化酶活性的影響

污染物經(jīng)過(guò)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程后會(huì)產(chǎn)生一定量的活性氧自由基，如果機(jī)體不及時(shí)清除會(huì)產(chǎn)生氧化損傷。在防御機(jī)體氧化損傷過(guò)程中，SOD、CAT和GPx 3種酶是起主要作用的抗氧化酶，SOD可以催化氧自由基(O－2·）歧化生成H2O2，CAT可以分解H2O2成為H2O和 O2，GPx可以催化 H2O2分解為H2O或使許多脂質(zhì)過(guò)氧化物還原為正常狀態(tài)［19］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，雙齒圍沙蠶的這3種抗氧化酶活性隨著B(niǎo)(a）P暴露時(shí)間的延長(zhǎng)均呈明顯的上升趨勢(shì)，表明隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)機(jī)體內(nèi)活性氧自由基大量產(chǎn)生，SOD活性的升高可以消除活性氧自由基，CAT和GPx酶活性的變化趨勢(shì)具有一致性，這兩種酶活性的提高可以去除代謝中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，從而減少生物體受到氧化損傷的風(fēng)險(xiǎn)。這一變化趨勢(shì)與其他研究結(jié)果相類(lèi)似［8，17，20 －22］。

但SOD與CAT和GPx酶活性的變化并不一致，在50 μg/L B(a）P誘導(dǎo)條件下，沙蠶SOD活性的上升趨勢(shì)明顯低于5 μg/L B(a）P濃度組，而CAT和GPx活性則與B(a）P濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。不少研究表明，SOD、CAT和GPx之間存在一定的正相關(guān)性，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)酶之間不一定存在正相關(guān)。本試驗(yàn)中產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能與CYP家族在多環(huán)芳烴代謝中的作用有關(guān)。Livingstone等［23］在研究沙丁魚(yú) Limanda limanda的抗氧化酶活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，SOD和CAT變化趨勢(shì)并不一致，推斷成因是由于H2O2的來(lái)源不只是SOD催化的歧化反應(yīng)產(chǎn)物，它還可以通過(guò)氨基酸或細(xì)胞色素P450氧化酶激活。本試驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)與這一結(jié)果相一致，在進(jìn)行B(a）P對(duì)雙齒圍沙蠶抗氧化酶活性影響研究的同時(shí)，也進(jìn)行了B(a）P對(duì)雙齒圍沙蠶CYP450基因表達(dá)的影響分析，發(fā)現(xiàn)B(a）P會(huì)誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。故推斷在雙齒圍沙蠶中H2O2的來(lái)源可能有一部分是通過(guò)細(xì)胞色素P450氧化酶來(lái)激活的。

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Effects of B(a）P exposure on antioxidant enzyme activity and CYP450 gene expression in sandworm Perinereis aibuhitensis

ZHAO Huan，ZHAO Xin－da，YUE Zong－h(huán)ao，ZHOU Yi－bing
(Key Laboratory of Marine Bio－resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

The influence of B(a）P exposure on three different antioxidant enzyme activities and CYP450 gene expression were investigated in sandwormPerinereis aibuhitensiswith body weight of 1.5 g ±0.5 g in an indoor experiment.The CYP450 gene expression was shown to be positively related to exposure time and dosage of B(a）P，with up－regulation with time elapse and increase in B(a）P concentration.There was increase in activities of superoxide dismutase(SOD），catalase(CAT）and glutathione peroxidase(GPx）with increase in B(a）P concentration and the exposure time.SOD activity，however，was exhibited by higher concentration of B(a）P，and the activities of CAT and GPx were shown to be positive relation with the B(a）P concentration.

Perinereis aibuhitensis;B(a）P;CYP450;antioxidant enzyme

X174;Q786

A

10.3969/J.ISSN.2095 －1388.2014.04.004

2095 －1388(2014）04 －0342 －05

2013－11－29

國(guó)家海洋局海洋溢油鑒別與損害評(píng)估技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金資助項(xiàng)目 (201217）;海洋公益性項(xiàng)目 (201305002，201305043）;國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (41306138，30901107）

趙歡 (1983—），女，博士，助理研究員。E－mail:zhaohuan@dlou.edu.cn

周一兵 (1957—），男，教授。E－mail:ybzhou@dlou.edu.cn